柠檬桉树脂多糖的提取纯化及其抗氧化活性的研究

何业通，马丽，李文，刘雄民，赖芳，陆顺忠

(1.广西大学 化学化工学院，广西 南宁 530004；2.广西民族大学 广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530006；3.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530009)

柠檬桉树脂(Eucalyptus citriodora Resin)是从柠檬按树(Eucalyptus citriodora)的树干受伤后流出的深褐色软脂，经过风化后成为黑色硬脂。柠檬桉树主要分布于国内气候高温湿润、阳光充足的广西、广东以及福建等地区[1]，已有研究表明其具有解毒敛创、抗肿瘤及驱虫功能等[2-3]。对柠檬桉树脂的有效成分的研究主要集中在黄酮、多酚类化合物[4-5]，对柠檬桉树脂多糖的研究鲜见报道。

本文通过水提醇沉法对柠檬桉树脂多糖进行提取，采用Sevage法和TCA法对提取的粗多糖进行去除蛋白质以及采用聚酰胺法去除色素，对纯化前后的ERP进行DPPH·和·OH清除测定。以期为ERP的开发利用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

葡萄糖、考马斯亮蓝G-250、浓硫酸、无水乙醇、苯酚、三氯乙酸、氯仿、正丁醇、七水合硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、牛血清蛋白、2,2-联苯基-1-苦基肼基、抗坏血酸(Vc)均为分析纯；聚酰胺粉末(100～200目)，层析柱用；柠檬桉树脂，采自广西民族大学校园内柠檬桉树。

UV-2550型紫外-可见分光光度计；RE-52A旋转蒸发仪；DL-6000B低速冷冻离心机；FA224分析天平。

1.2 实验方法

1.2.1 柠檬桉树脂的预处理 新鲜摘取的柠檬桉树脂去除树皮等杂质，风干捣碎后备用。

1.2.2 多糖的提取 取20 g预处理的柠檬桉树脂，采用热水浸提法按照料液比1∶20 (g/mL)于95 ℃油浴浸提3次，提取时间为4 h，取出水提液进行抽滤，3 000 r/min下离心15 min。将3次水提液混合并进行旋蒸浓缩，在得到的浓缩多糖水提液中缓慢加入体积分数比为75%的无水乙醇边加边搅拌，置于4 ℃ 冰箱保温过夜。将醇沉液进行3 000 r/min 离心15 min，用丙酮将沉淀物洗出，烘干后得到柠檬桉树脂粗多糖1.578 g。

1.2.3 苯酚-硫酸法测定ERP的含量[6]在490 nm 下测其吸光度。以浓度(mg/mL)为横坐标，以吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线的线性回归方程y=8.479x-0.021 1，决定系数R2=0.999 2，说明葡萄糖质量浓度在0～0.08 mg/mL 内在波长490 nm处的吸光值与质量浓度的线性关系良好。通过苯酚-硫酸法测得的多糖得率为7.79%。

1.2.4 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[7]在590 nm 处测定紫外吸光值，绘制蛋白质定量标准工作曲线y=0.034x+ 0.076 2，决定系数R2=0.999 2，说明牛血清蛋白质量浓度在3.333～16.667 μg/mL 内的波长590 nm处的吸光值与质量浓度的线性关系良好。

1.2.5 脱蛋白

1.2.5.1 Sevage法脱蛋白[8]分别取5份4 mL粗多糖提取液，再各加入1 mL Sevage试剂(氯仿∶正丁醇=4 mL∶1 mL)，摇匀3 min，然后将其于3 000 r/min 离心机中离心15 min去除沉淀，按照上述操作分别进行1，3，5，10,15次。

1.2.5.2 三氯乙酸(TCA)除蛋白 分别取5份4 mL 粗多糖提取液，加入TCA，分别得到1%，3%，6%，9%，12%的TCA溶液，振荡10 min，在4 ℃冰箱中冷藏过夜。用考马斯亮蓝法、苯酚-硫酸法分别测定蛋白质去除率和多糖的保留率[9]。

1.2.5.3 多糖保留率和蛋白的去除率的计算 两种方法均采用考马斯亮蓝法测定590 nm处吸光值，按照如下公式可计算蛋白质去除率(R1，%)：

(1)

式中A1——未除蛋白的吸光度；

A2——除蛋白后吸光值。

采用苯酚-硫酸法测定490 nm处吸光值，按照下式计算多糖保留率(R2，%)：

(2)

式中MP——脱蛋白前多糖含量，g；

M——脱蛋白后多糖含量，g。

1.2.6 聚酰胺(PA)柱层析法脱色 选用3.5 cm×40 cm聚酰胺层析柱，装柱：采用湿法装柱，聚酰胺的用量与样品的比值为50 mL∶1 g。上样：采用湿法上样。洗脱：洗脱液为蒸馏水，流速为3 mL/min，用苯酚硫酸法进行检测，洗脱至流出液中检测不出糖。收集干燥浓缩，测其多糖的保留率[10]。通过紫外分光光度计在420 nm处测量多糖脱色前后的吸光度，按照如下公式可计算脱色率(R3，%)：

(3)

式中A1——脱色前的吸光度；

A2——脱色后的吸光度。

1.2.7 抗氧化活性测定

1.2.7.1 DPPH·自由基清除测定[11]分别移取2.0 mL浓度为9，12，15，18，21，24，27 mg/mL的Vc、ERPC、ERP1和ERP2，加入0.05 mg/mL DPPH·溶液，混匀并避光放置30 min，以无水乙醇做参比，测519 nm处的吸光值，平均测定3次，取其平均值。

DPPH·自由基清除率(S1，%):

(4)

式中A0——未加入样品液的DPPH吸光值；

Ai——不同浓度样品液与DPPH·反应后的吸光值。

1.2.7.2 ·OH自由基的清除测定 采用水杨酸法[12]测定Vc、ERPC、ERP1和ERP2对·OH的清除能力。分别移取各样液中不同浓度(14.8，18.5，22.2，25.9，29.6，33.3，37 mg/mL)各1 mL，加入9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L水杨酸溶液和8.8 mmol/L H2O2各1 mL，37 ℃水浴30 min，以蒸馏水为空白，测510 nm波长下的吸光值。

·OH自由基清除率(S2，%):

(5)

式中A0——空白对照的吸光值；

Ai——加样品的吸光值；

Aj——未加入H2O2的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 两种脱蛋白方法效果比较

2.1.1 Sevage法 由表1可知，随着处理次数的增加，蛋白质的清除率不断地升高，处理次数越高则蛋白的清除率越高。当处理次数达到10次时，蛋白质清除率达到79.51%，多糖的保留率在53.45%。处理次数增加会导致多糖含量的减少，处理次数达到15次时，蛋白的清除率达到85.17%，但多糖的保留率只有18.97%，虽然有较好的蛋白去除率，但由于处理次数过多，导致多糖的损失明显增加，且成本较高，操作繁琐。

表1 Sevage法脱蛋白结果表Table 1 Deproteinization results of Sevage method

2.1.2 TCA法脱蛋白结果 由表2可知，随着TCA的浓度增加，蛋白质的清除率不断地升高，多糖的保留率逐渐减少，当TCA浓度在6%时，蛋白质的清除率达到94.79%，多糖的保留率为82.99%，当TCA浓度达到12%时，蛋白质的清除率达到98.90%，由于TCA浓度增大使得酸性较强，可能导致部分多糖降解，从而使得多糖出现较大的损失。所以多糖的保留率下降，仅为56.21%。

表2 TCA法脱蛋白结果Table 2 Deproteinization results by TCA method

对比Sevage法和TCA法对ERPC进行除蛋白，结果表明，TCA法较Sevage法对ERPC的除蛋白质效果更好，且操作简单，TCA的浓度在6%时，脱蛋白的效果最好，且多糖的保留率也相对较高。

2.2 聚酰胺(PA)法对除蛋白后的多糖进行脱色和分离

以收集洗脱液的试管序号为横坐标，经苯酚-硫酸法测定的各收集管中洗脱液在490 nm处的吸光值(A)为纵坐标，绘制出聚酰胺分离柱的洗脱曲线见图1。

图1 聚酰胺洗脱曲线Fig.1 Polyamide elution curve

由图1可知，在7～15管和31～35管处有波峰，对两个部分分别进行收集、浓缩。

对浓缩后的产物在420 nm处进行紫外光谱扫描。通过公式(3)得到脱色率为77.95%,多糖的保留率为71.94%，其中ERP1含量为31.43%，ERP2含量为40.51%。

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 对DPPH·自由基清除能力 同质量浓度的ERPC、ERP1、ERP2以及Vc清除DPPH·自由基的能力的实验结果见图2。

由图2可知，ERPC、ERP1、ERP2以及Vc均对DPPH自由基具有一定的清除作用，其清除能力由大到小为：Vc>ERPC>ERP2>ERP1。四者均随着质量浓度的增加，对DPPH·自由基的清除作用呈先增加后趋于平衡的趋势[13]。在质量浓度9～27 mg/L 内，以清除率(y)与质量浓度(x)的关系进行线性拟合见表3。利用拟合方程计算得到相应的IC50值，说明经过纯化后对DPPH·自由基依旧保持相对较好的清除效果。

图2 ERPC、ERP1、ERP2、Vc不同浓度试样对DPPH·的清除能力Fig.2 DPPH· scavenging capacity of samples with different concentrations of ERPC,ERP1,ERP2 and Vc

表3 试样质量浓度(x)与DPPH·自由基清除率(y)的关系Table 3 Relationship between sample mass concentration (x) and DPPH · radical scavenging rate (y)

2.3.2 对·OH的清除测定 同质量浓度的ERPC、ERP1、ERP2以及Vc清除·OH的能力的实验结果见图3。

图3 ERPC、ERP1、ERP2、Vc不同浓度试样对·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of polysaccharide crude extract,ERP1,ERP2 and Vc on ·OH

由图3可知，在实验浓度范围内，各样液对·OH 清除作用随着浓度的增加清除率增大。各样液的清除能力大小为：Vc>ERPC>ERP1>ERP2。在实验浓度范围内，ERPC的最高清除率为88.54%，ERP1的最高清除率为48.42%，ERP2的最高清除率为35.67%。在质量浓度15～37 mg/mL 内，以清除率(y)与质量浓度(x)的关系进行线性拟合见表4。利用拟合方程计算得到相应的IC50值，说明ERP经过纯化后对·OH自由基依旧保持相对较好的清除效果。

表4 试样质量浓度(x)与·OH自由基清除率(y)的关系Table 4 Relationship between sample mass concentration (x) and ·OH radical scavenging rate (y)

3 结论

本文利用水提醇沉法对ERP进行提取，得到的多糖提取率为7.79%。比较了Sevage法和TCA法对ERPC去除蛋白质的应用效果，其中TCA法除蛋白质的效果较好，同时多糖的保留率相对较高，在TCA浓度达到6%时，多糖的保留率达到了82.99%，蛋白去除率为94.79%。通过聚酰胺柱层析对脱蛋白后的ERP进行除色，除色率达到77.95%，多糖的保留率为71.94%。并得到ERP1、ERP2两种多糖纯化物组分。

对ERPC、ERP1和ERP2三者进行了DPPH·和·OH自由基清除测定，实验表明，在实验浓度范围内，ERPC、ERP1和ERP2随着浓度的增加对DPPH·和·OH的清除率逐渐增加，其中对DPPH·均有较好的清除作用，三者对DPPH·自由基清除的IC50值分别为9.82，13.6，11.3 mg/L，而ERP1和ERP2对·OH的清除能力较弱，三者对·OH自由基清除的IC50值分别为23.6，26.9，53.7 mg/mL。综上所述，ERP经过纯化后其多糖仍具有一定的抗氧化活性，为柠檬桉树脂多糖的开发利用提供了理论参考。