NaHCO3胁迫对三色堇生长及抗逆生理特性的影响

刘小娥，苏世平

(甘肃农业大学 林学院，兰州 730070)

土壤盐渍化已经成为制约农业生产的主要问题之一，据报道中国目前有盐渍化土地面积约3 600 万hm2[1-2]，占中国耕地面积的4.88%[2-4]，占全球盐碱地面积的3.6%，预计到2050年，50%的可用耕地将面临盐渍化威胁[4]，因此，盐碱化土地的治理显得尤为重要。在农业生产中不合理的施肥和灌溉容易引起土地盐碱化，一方面，在灌溉过程中，由于水质不达标，导致水中的盐分随灌溉进入土壤；另一方面，由于不合理的灌溉，导致水分渗入土壤深层，将土壤深层残存的盐分溶解后通过土壤水分蒸发运移到土壤表层，加速了土壤盐渍化。

土壤盐渍化发生后，对植物造成盐胁迫，严重影响植物的正常生长发育。植物在遭受盐胁迫时，渗透调节物质[游离脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)]含量出现不同程度的升高[5-8]，抗氧化酶[过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)]活性在低盐浓度下呈升高趋势，随着盐浓度的增加而逐渐降低[9-10]，光合色素含量也随盐浓度的升高呈现出先升高后降低的趋势[11]；植物在盐胁迫时表现出生物产量降低，植株高生长减缓、根系生长受限，叶片变小，出现坏死斑点等受害症状[12]。不同种类的盐胁迫，如酸性盐、中性盐和碱性盐，对植物的作用机理不同，同时植物对盐胁迫的耐受程度因盐分种类和盐分浓度的不同而不同[13]。中国西北地区土壤盐分主要以中性盐和碱性盐为主，而NaHCO3是常见的碱性盐。植物在NaHCO3胁迫下，由于Na+的胁迫而导致细胞膜的结构和功能发生改变，细胞膜上原有的Ca2+被Na+取代，使细胞膜出现微小漏洞而引起原生质等产生渗漏，导致细胞内的离子种类和浓度发生变化，也会因盐分在细胞内大量积累引起原生质凝固，造成叶绿素破坏，光合作用速率急剧下降[11,14]，严重影响植物的生长发育。NaHCO3胁迫除了引起离子毒害和渗透胁迫外，还有高的pH胁迫，pH升高导致Fe2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等金属离子的有效性降低[15]，从而造成植株生理代谢障碍，导致生长受抑。

三色堇(Violatricolor)隶属于堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)，为多年生草本，喜排水良好、肥沃、富含有机质的pH为5.4～7.4的弱酸性、中性壤土或粘壤土生长，常用作花坛、花池、花镜以及模纹花坛摆放的材料，同时三色堇全株可入药，具有散瘀、止咳、清热解毒的功能；也有研究表明，三色堇花朵富含黄酮、花青素和类胡萝卜素[16]，有较高的食用价值。因此，随着三色堇使用价值的不断扩展，其栽培面积将不断增加，三色堇的研究将会越来越多地受到关注。目前对三色堇的研究多集中在栽培、干旱胁迫[17]、NaCl胁迫[18-19]、高温胁迫[20-22]及重金属胁迫[23]等方面。其中，在盐胁迫方面的研究，分别集中在渗透调节物质(Pro、SS、SP)、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)、生长、膜脂过氧化(MDA)等方面，而关于三色堇在NaHCO3胁迫下生理生化方面的研究比较少见；同时，植物的耐盐性不是某一个指标或某一类指标的单独表现，而是众多生理生化特性综合作用的结果。因此，本研究以三色堇为研究材料，采用不同浓度NaHCO3处理，探讨在NaHCO3胁迫下三色堇植株渗透调节物质、抗氧化酶、光合色素、膜质过氧化产物以及生长方面的响应机理，以及三色堇对土壤NaHCO3胁迫的生理耐受限度，为今后盐碱地三色堇的栽培提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料培育

试验所用材料为种子播种获得的三色堇实生苗。将基质(丹麦生产)先用蒸馏水浸泡48 h后，倒掉水分，再用蒸馏水冲洗3～5次，以清除基质中可溶性离子；之后，用50%(g/V)的可湿性多菌灵粉剂灭菌后密封5 d，然后装入营养钵(直径100 mm，高150 mm)供播种用。播种时将基质用蒸馏水浇透，每钵播种2粒种子，等萌发后长出2片真叶时每营养钵保留1株幼苗；每隔7 d用霍格兰氏(Hoagland’s)营养液浇灌1次，每盆200 mL；待幼苗生长45 d(5～6片真叶)时进行NaHCO3胁迫处理，NaHCO3处理过程中不再浇灌Hoagland’s营养液。

1.2 试验处理

试验设置0(蒸馏水浇灌，CK)、25、50、100、150、200 mmol·L-16个浓度NaHCO3处理，每处理3次重复，每重复30株(钵)，每2 d处理1次。为避免盐冲激效应，对浓度高于25 mmol·L-1的处理，每隔1 d用高一浓度处理液进行浇灌，直至到达设定浓度后，每隔1 d用目标浓度的处理液浇灌1次，每次灌溉量为基质持水量的2倍，确保有2/3的处理溶液流出，以此将前期集余盐分冲洗掉，以保证NaHCO3浓度恒定[24]，在全部处理达到目标浓度的一天定为盐胁迫处理的第1天。本研究中，蒸馏水pH值为7.01，各浓度NaHCO3溶液pH值均为8.30。灌溉浓度顺序见表1。在处理的第7天和14天，每重复随机选择10株幼苗进行生长指标和生理指标测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生理指标在每重复的30株三色堇幼苗中随机选择10株，每株选择大小一致的叶片3片，共30片，装入液氮中，供生理指标测定，每个指标测定时，用直径为0.5 cm的打孔器进行每叶片取样，混合叶片样品作为测定样品。游离脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸提取法测定；可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法测定；可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝染色法测定；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定，MDA采用硫代巴比妥酸法测定，叶绿素含量采用酒精提取法测定。以上方法参考李合生[25]、高俊凤[26]的方法。

1.3.2 株高生长量在处理的第0天、第7天、第14天测定三色堇幼苗茎基部至顶芽处的高度，分别记为H0、H7、H14(cm)，据此计算株高净生长量。

Δi=Hi-H0

式中，Δi为处理后第i天的株高净生长量，H0为处理第0天的株高，Hi为处理后第i天的株高，i=7或14。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS17.0软件进行方差分析，各处理之间差异性检验采用Duncan检验，采用Microsoft Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3胁迫对三色堇株高生长的影响

图1显示，随着NaHCO3处理浓度的增加，三色堇植株株高生长量呈现先增加后减少的趋势，并在25 mmol·L-1处理下达到最高值；株高生长量在处理浓度小于或等于50 mmol·L-1时高于对照(0 mmol·L-1)，在其余处理浓度下均不同程度低于对照。其中，在NaHCO3处理14 d后，三色堇株高生长量在25、50 mmol·L-1处理下显著高于对照(0.68 cm)45.59%(P<0.05)，在100 mmol·L-1时与对照相等(P>0.05)，在150和200 mmol·L-1分别比对照显著降低16.18%和27.94%(P<0.05)。可见，三色堇植株对NaHCO3胁迫具有一定的耐受性，且有在低浓度(≤50 mmol·L-1)下对高生长有显著促进作用，高浓度(>100 mmol·L-1)显著抑制的效应。

2.2 NaHCO3胁迫对三色堇叶片渗透调节物质含量的影响

三色堇幼苗叶片的可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)和脯氨酸(Pro)含量经NaHCO3处理后均高于对照。随着处理浓度的增加，三色堇叶片SP含量在处理的第7天和第14天均呈先上升后下降的趋势，并均在处理浓度为50 mmol·L-1时达到最高值，在此浓度处理第7天和第14天时分别比对照显著增加了143.93%和140.86%(P<0.05)；各浓度处理第14天的SP含量在低浓度(≤50 mmol·L-1)时高于第7天，而在高浓度(>50 mmol·L-1)时低于第7天。在浓度为200 mmol·L-1时，SP含量在处理第7天和第14天时分别比对照显著增加了103.34%和58.15%(P<0.05)(图2，A)。

随着NaHCO3处理浓度的增加，三色堇植株叶片SS和Pro含量在处理的第7天呈持续升高趋势，在第14天呈先上升后降低的趋势。其中，叶片SS含量在NaHCO3胁迫处理第14天时以浓度为50 mmol·L-1时含量最高，比对照显著增加了450.39%，在浓度为200 mmol·L-1时比对照显著增加了338.91%(P<0.05)；除200 mmol·L-1处理以外，叶片SS含量在各浓度处理第14天时显著高于第7天，且均显著高于对照(P<0.05)(图2，B)。同时，叶片Pro含量在NaHCO3胁迫处理的第14天以浓度为150 mmol·L-1时最高，比对照显著增加了112.12%，在浓度为200 mmol·L-1时比对照增加了89.26%(P<0.05)；随着处理时间的延长，盐胁迫处理第14天时Pro含量均明显低于第7天的，且盐胁迫浓度越高差异越大，但两时段各浓度处理均高于对照(图2，C)。

2.3 NaHCO3处理对三色堇叶片抗氧化酶活性的影响

NaHCO3在一定浓度范围内能显著提高三色堇幼苗叶片的抗氧化酶活性(图3)。随着NaHCO3处理浓度的增加，三色堇幼苗叶片POD、SOD和CAT活性在处理的第7天和第14天均呈先上升后降低的趋势，且在处理第14天变化幅度较大。其中，在处理的第14天，三色堇幼苗叶片POD活性在NaHCO3胁迫浓度为50 mmol·L-1时最高，比对照显著增加了108.07%(P<0.05)；在盐浓度为200 mmol·L-1时比对照降低了3.31%，但差异不显著(P>0.05)；随着处理时间的延长，各浓度处理叶片POD活性在第14天均明显高于第7天(图3，A)。

同时，在盐胁迫处理的第14天，三色堇叶片SOD活性在胁迫浓度为100 mmol·L-1时最高，比对照显著增加了65.18%(P<0.05)；在胁迫浓度为200 mmol·L-1处理比对照降低了1.75%，但差异不显著(P>0.05)；随着胁迫处理时间的延长，除100 mmol·L-1处理外，其他浓度处理第14天的 SOD活性均低于第7天(图3，B)。

另外，在盐胁迫处理的第14天，三色堇叶片CAT活性胁迫浓度为50 mmol·L-1时最高，比对照显著增加了156.96%(P<0.05)；在盐浓度为200 mmol·L-1时比对照显著升高了74.84%；随着盐胁迫处理时间的延长，各浓度处理第14天时CAT活性均显著高于第7天(图3，C)。

2.4 NaHCO3处理对三色堇叶片叶绿素含量的影响

随着NaHCO3处理浓度的增加，三色堇叶片叶绿素含量(总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b)在处理第7天和第14天均呈现出先升高后降低的趋势；第14天叶绿素含量在对照和25 mmol·L-1时高于第7天，在其余浓度下均低于第7天(图4，A～C)。其中，在盐胁迫处理的第14天，胁迫浓度为25 mmol·L-1时最高，叶片总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量分别比对照增加了7.92%、8.50%和6.12%，但差异不显著(P>0.05)；在浓度为200 mmol·L-1时分别比对照显著降低了23.26%、28.95%和5.92%(P<0.05)。

2.5 NaHCO3处理对三色堇叶片MDA含量的影响

图5显示，随着NaHCO3处理浓度的增加，三色堇叶片MDA含量在处理后第7天和第14天均呈现出持续升高的趋势，且第14天始终高于第7天，但在各浓度处理下均与对照有显著差异(P<0.05)。其中，在盐胁迫处理的第14天，叶片MDA含量胁迫浓度为200 mmol·L-1时最高，比对照显著增加了81.90%。

3 讨 论

NaHCO3是干旱半干旱地区土壤中最常见的碱性盐[27]，当土壤中NaHCO3含量过高时，对植物会产生Na+和pH胁迫，对植物的生长造成不良影响，严重时会使植物代谢失调，甚至死亡[28]。生长量是植物的生理生化过程反馈于植物的外在表现，也是能用肉眼直接观测到的表型特征，对逆境胁迫下植物的抗逆能力能进行直观的测定，植物在逆境环境下的生长量与抗逆能力呈正相关，生长好，则表明其抗逆能力高[29]。本研究中，在NaHCO3浓度小于等于100 mmol·L-1处理下，三色堇株高生长量高于或等于对照，而当盐浓度大于100 mmol·L-1时，三色堇株高生长量随着盐浓度的升高明显下降。可见，土壤中存在一定浓度的NaHCO3(≤100 mmol·L-1)有利于三色堇植株的生长，但当土壤中盐浓度过高时(>100 mmol·L-1)对三色堇的高生长造成抑制。这与张木清等对NaCl胁迫下甘蔗(Saccharumofficinarum)的相关研究结果相同[30]。

同时，植物在盐胁迫条件下会通过主动积累渗透调节物质SS、SP、Pro等来维持细胞渗透势，避免盐分过多地进入细胞，从而降低逆境胁迫对植物的危害程度，其累积量与抗逆能力呈正相关[31]。本研究发现，三色堇植株在NaHCO3胁迫下，其叶片SS、SP、Pro积累量显著高于对照，说明三色堇在NaHCO3胁迫下能通过提高细胞内的渗透调节物质的含量来提高细胞的渗透压，维持细胞的吸水和保水能力，减缓盐胁迫对细胞的伤害，这与Al-Farsi等对盐胁迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)的相关研究结果一致[32]。

另外，植物在逆境胁迫下会通过提高抗氧化酶活性来清除过氧化氢、超氧阴离子等ROS(活性氧)，以减缓ROS对植物细胞的伤害[9,31]，其活性与植物的抗逆性呈正相关。本研究发现，三色堇植株经NaHCO3处理后，其叶片中SOD、POD、CAT活性整体呈现先升高后降低趋势；在盐浓度小于等于150 mmol·L-1时，SOD、POD、CAT活性高于对照，当盐处理浓度大于150 mmol·L-1时，除CAT活性外，SOD、POD活性均低于对照，说明NaHCO3盐浓度过高会加剧了三色堇细胞膜脂过氧化。渗透调节物质含量和抗氧化酶活性在盐胁迫处理14 d时均表现出随浓度的升高而降低的趋势，这可能是当NaHCO3浓度高于三色堇自身能调节的范围时，导致渗透调节系统和抗氧化酶系统紊乱，防御系统活性已不能维持较高水平，进而抑制了三色堇的生长和发育，这与梁晓艳等对NaCl胁迫下花生(Arachishypogaea)的相关研究结果一致[3]。

此外，叶绿体是植物进行光合作用的主要细胞器，在盐胁迫条件下，由于金属离子的毒害作用，导致叶绿体内叶绿素降解[33]，其降低程度与植物所受离子胁迫程度呈现正相关。本研究发现，在NaHCO3胁迫第14天时，三色堇叶片叶绿素含量以25 mmol·L-1处理时最高，超过此浓度后叶绿素降解速度加快，含量迅速降低，从而降低了光合速率，抑制了三色堇的正常生长，这与吕秀云等对盐胁迫下藜(Chenopodiumalbum)的相关研究结果一致[34]。

最后，MDA是细胞膜脂质过氧化的产物，其含量与植物的抗逆性呈负相关[29]，因此可以用MDA含量评价植物的抗逆境能力。本研究发现，三色堇植株经NaHCO3胁迫后，叶片MDA含量在整个胁迫处理期间均呈持续升高趋势，说明随着NaHCO3浓度的升高胁迫程度加剧，对质膜系统的伤害持续加大，这与膜质过氧化而引起的细胞膜受损导致的电解质外渗有关。细胞膜是外界盐离子进入植物细胞的第一道屏障，在植物抗盐生理中有重要作用[35]，当细胞组织受到离子胁迫时，三色堇体内自由基的大量产生引发膜脂过氧化[36]，细胞膜的完整性和功能受到伤害，膜的稳定性降低，导致细胞内的原生质体和大分子物质通过损伤部位大量外溢[35-37]，影响三色堇的正常代谢，严重时会导致细胞死亡。同时，有研究表明，当土壤中Na+过高时，Na+将会取代细胞膜上的Ca2+，导致细胞膜出现漏洞，细胞内原生质体外渗，进而引起离子种类和离子浓度发生改变，这与李子英等对盐胁迫下柳树(Salixpsammophila)的相关研究结果一致[29]。

4 结 论

NaHCO3处理三色堇植株后，对其叶片抗氧化酶活性、渗透调节物质含量、光合色素含量、丙二醛含量以及株高生长量产生了显著影响。在处理后14 d，随NaHCO3浓度的升高，其叶片可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素含量和过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，以及株高生长量均表现出先升高后降低的趋势，而丙二醛含量呈持续升高趋势。