穴位埋线调控NLRP3炎症小体及IL-27表达对溃疡性结肠炎大鼠的黏膜保护作用

刘朝霞,李玎玎,许晓男,王 喆△

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种以血性腹泻和里急后重为主要症状的慢性炎症性肠病，其病程迁延，病情反复，可造成肠黏膜持续炎症反应，严重影响患者生活质量[1]。穴位埋线是以针灸理论为指导的一种传统中医外治法，以羊肠线埋入腧穴，通过肠线在穴位长效的刺激作用，达到“深纳而久留之，以治顽疾”的目的，对UC症状具有明显的改善作用，且副作用较小，已广泛应用于UC的临床治疗[2]。然而，关于其对UC的研究报道仍较少。UC的病因和发病机制较为复杂，目前研究认为是由遗传、感染、免疫异常、环境以及饮食等多种因素共同作用下引发肠黏膜免疫炎性反应，从而导致黏膜结构和功能受损[3]。白细胞介素-27(Interleukin-27,IL-27)是近年发现的一种新型炎性细胞因子，在炎症进程中具有抗炎和促炎的双向调控作用，参与多种自身免疫性疾病的发生[4]。含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)是存在于细胞质内的一类多蛋白复合物，活化的NLRP3炎症小体具有强大的促炎活性，能够引起多种炎症介质的表达，是导致UC病情加重的重要机制之一[5]。有研究发现[6]，IL-27可通过抑制NLRP3的激活和表达来减轻UC炎症程度。本研究通过观察穴位埋线对UC大鼠IL-27及NLRP3炎症体表达的影响，探讨穴位埋线治疗UC的作用机制，为其临床治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠42只，雄性，体质量200～220 g，由黑龙江中医药大学提供，动物合格证号：SYXK黑2021-010，于SPF级实验动物房中饲养，室内温度保持20～22 ℃，相对湿度50%，光照与黑暗交替各12 h。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 柳氮磺胺吡啶(SASP)肠溶片(0.25 g/片),上海福达制药有限公司，批号：990608)；葡聚糖硫酸钠(MP Biomedicals公司，批号：M8669);7号无菌埋线针(镇江高冠医疗器械有限公司);可吸收外科缝线(山东博达医疗有限公司);白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)、γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-27(IL-27)大鼠ELISA试剂盒(深圳达科为生物技术有限公司，批号分别为：20210612、20210529、20210510和20210526)；抗含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)和IL-27抗体(Santa Cruz公司，批号分别为：058206、059150和052243)；RNA提取、逆转录试剂盒(TaKaRa公司，批号分别为：DR060A、D543A，基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司提供，货号：S0419)。

1.2.2 仪器 组织切片机(Leica公司，型号：RM 2235);光学显微镜(Leica公司，型号：DM750);多功能酶标仪(Tecan 公司，型号：GENIOSPLOS);电泳仪、电转仪(Bio-Rad公司，型号：EC3 型);RCR仪(ABI公司，型号：9902)。

1.3 模型建立与治疗

大鼠适应性饲养1周后，随机抽取10只作为空白组，其余大鼠自由饮用3%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液7 d，以建立UC模型。造模结束后抽取2只大鼠取结肠组织，行HE染色观察病理形态改变，以出现腹泻、血便等症状及光镜下结肠黏膜弥漫性破坏、炎症细胞浸润和溃疡形成为模型建立成功[7]。造模成功后，将其余大鼠按体质量随机分为模型组、药物组和穴位埋线组，每组各10只。药物组给予SASP溶液0.5 g/kg连续灌胃治疗14 d；穴位埋线组选取双侧“足三里”“上巨虚”“天枢”“大肠俞”给予穴位简易埋线治疗，穴位参照《实验针灸学》进行定位，将羊肠线(0.5 cm)置于0.9%生理盐水清洗后，以7号无菌埋线针推入上述腧穴内，其中“足三里” “上巨虚”直刺，“天枢”“大肠俞”从腧穴下方向上平刺，将针芯推出时同时退出针管，将羊肠线埋入后，用医用药棉按压针孔1 min，每7 d干预1次，共治疗3次。空白组及模型组正常饲养，不予处理。

1.4 观察指标

1.4.1 一般状况及DAI、CMDI评分 观察记录各组大鼠精神状况、体质量、进食饮水、大小便及粪便性状等情况变化，治疗结束后参照文献[8-9]进行疾病活动度指数(DAI)和结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分。DAI评分：体质量不变为0分，减轻1%～5%为1分，减轻6%～10%为2分，减轻11%～15%为3分，减轻>15%为4分；粪便性状正常为0分，松散呈半稀状为2分，稀疏黏稠为4分；粪便无潜血为0分，潜血阳性为2分，显性血便为4分。DAI=(体质量评分+粪便性状评分+潜血评分)/3。CMDI评分：未见肠黏膜损伤为0分；肠黏膜轻度充血水肿，未出现溃疡、糜烂为1分；肠黏膜轻、中度充血水肿，出现糜烂、粘连为2分；肠黏膜高度充血水肿，出现坏死、溃疡(直径<1 cm)为3分；肠黏膜溃疡较大(直径>1 cm)或全肠壁坏死为4分。

1.4.2 结肠长度及组织病理学变化观察 治疗结束后，测量各组大鼠结肠组织全结肠长度，随后将结肠纵行剪开，0.9%生理盐水清洗后，取部分组织置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，依次放入低浓度到高浓度乙醇溶液中浸泡脱水，再置于二甲苯中透明，液体石蜡包埋，冷却后切片机作5 μm切片，HE 染色，再经脱水、透明后封片，光学显微镜观察结肠组织形态学变化并拍照。

1.4.3 血清IL-18、IL-1β、IFN-γ及IL-27水平检测 治疗结束后，各组大鼠腹主动脉取血，3 000 r/min下离心15 min分离血清，置于-20 ℃冰箱中保存待测。按照ELISA试剂盒操作步骤进行检测：血清临用前于室温下平衡1 h，3 000 r/min下离心15 min，样品孔分别加入待测样品10 μL，样品稀释剂40 μL和酶标抗体100 μL，同时设置空白孔和标准孔，于37 ℃温箱中反应1 h，加入洗涤剂清洗6次，加底物液显色，于37 ℃温箱避光反应15 min后，加入终止液以终止反应，酶标仪450 nm下检测各孔OD值，根据标准孔OD值建立标准曲线，代入各样品孔OD值得出血清样本中IL-18、IL-1β、IFN-γ及IL-27的水平。

1.4.4 结肠组织NLRP3、caspase-1及IL-27蛋白表达检测 取各组大鼠结肠组织100～200 mg，置于-80 ℃冰箱中冻存备用。待病理和血清指标检测结束后，每组分别选取5只大鼠，结肠组织于常温下解冻，无菌剪剪碎，匀浆机匀浆，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法于562 nm下测定总蛋白浓度。配置 SDS-PAGE凝胶，加入电泳缓冲液，将10 μL蛋白样品加入上样孔，经电泳分离后转入PVDF 膜，加入5%TBST脱脂奶粉，于室温下封闭2 h，滴加一抗于4 ℃冰箱孵育过夜，滴加二抗于室温孵育2 h，加入显影液显色，采用凝胶成像系统曝光并拍照。重复3次独立实验，采用Image J 软件定量分析各条带灰度值，以GAPDH为内参，分析各组蛋白相对表达量。

1.4.5 结肠组织NLRP3、 caspase-1及IL-27 mRNA表达检测 取各组大鼠结肠组织50 mg，置于-80 ℃冰箱中冻存待测，每组分别选取5只大鼠，结肠组织室温下自然解冻，无菌剪剪碎成若干碎块，Trizol一步法提取组织总RNA，采用紫外分光光度仪测定RNA 浓度，将RNA逆转录为 cDNA，随后进行常规PCR 扩增，PCR反应条件为94 ℃，5 min; 95 ℃，30 s;60 ℃，30 s;72 ℃，30 s，共扩增 40个循环，循环完毕后72 ℃ 延伸5 min。重复3次独立实验，结果以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法分析结肠组织NLRP3、caspase-1及IL-27的相对mRNA表达量。基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般情况和DAI、CMDI评分

各组造模过程中均未出现大鼠死亡。空白组精神状况良好，进食、饮水量及大小便正常。模型组造模后精神不佳，少食懒动,体重减轻明显，大便频次增加、呈稀便或黏液状血便。模型组DAI、CMDI评分与空白组比较显著升高(P<0.01)。药物组和穴位埋线组大鼠治疗后精神状况逐渐转好，食量增多，体质量减轻趋势缓和，稀便、黏血便症状明显改善，DAI、CMDI评分较模型组显著下降(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠 DAI、CMDI评分比较

2.2 大鼠结肠长度

模型组大鼠与空白组比较，结肠长度明显缩短(P<0.01)。药物组和穴位埋线组大鼠经治疗后，结肠长度较模型组明显增长(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠结肠长度比较

2.3 大鼠结肠组织形态学变化

HE染色可见，空白组大鼠结肠黏膜完整，腺体排列规则，肠腺上皮细胞结构正常，未见溃疡和炎性细胞浸润。模型组黏膜结构损伤严重，可见黏膜上皮变薄，中性粒细胞浸润丰富，结肠黏膜溃疡明显、黏膜下层及肌层可见较多炎性细胞浸润。药物组和穴位埋线组大鼠经治疗后，肠黏膜损伤较模型组明显改善，黏膜结构相对完整，腺体排列良好，溃疡减轻，可见轻微充血和水肿，炎性细胞浸润减少。见图1。

2.4 大鼠血清中炎性因子表达水平

模型组大鼠与空白组比较，血清中IL-18、IL-1β及IFN-γ的水平显著升高，IL-27的水平明显降低(P<0.01)。药物组和穴位埋线组大鼠血清IL-18、IL-1β、IFN-γ的水平较模型组明显降低，IL-27的水平较模型组明显升高(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠血清中IL-18、IL-1β、IFN-γ及IL-27水平比较

2.5 大鼠结肠组织中NLRP3、caspase-1及IL-27的蛋白表达

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中NLRP3、caspase-1的蛋白表达明显增多，IL-27表达显著减少(P<0.01)。药物组和穴位埋线组NLRP3、caspase-1蛋白表达较模型组显著减少，IL-27表达与模型组比较明显增多(P<0.01)。见图2、表5。

表5 各组大鼠结肠组织中NLRP3、caspase-1及IL-27蛋白比较

2.6 大鼠结肠组织中NLRP3、caspase-1及IL-27 mRNA表达

模型组大鼠结肠组织中NLRP3、caspase-1 mRNA表达较空白组明显增多，IL-27 mRNA表达显著减少(P<0.01)。与模型组比较，药物组和穴位埋线组NLRP3、caspase-1 mRNA表达显著减少，IL-27 mRNA表达明显增多(P<0.01)。见表6,各基因溶解曲线见图3。

表6 各组大鼠结肠组织中NLRP3、caspase-1及IL-27 mRNA比较

3 讨论

UC以结肠黏膜糜烂、溃疡、弥漫性炎症等病变及腹泻、黏液血便与体质量减轻等临床症状为主要特征，病程迁延，发作与缓解常反复交替，且具有一定的癌变风险，被世卫组织列为现代疑难疾病之一[10]。目前临床常依靠促肾上腺皮质激素、抗感染及免疫抑制剂控制UC症状，然而药物所引起的副作用较多，停药后复发率高，且部分难治性患者应用药物治疗后未见改善迹象[11]。中医立足整体，善于辨证施治，在UC的诊治过程中展现了较大优势。近年来，针刺、艾灸和穴位埋线等中医外治法作为辅助疗法已在UC的临床治疗中得到广泛应用[12]。

穴位埋线是将羊肠线埋入腧穴，由局部的机械性刺激激活腧穴特定功效，并产生一种持久而柔和的针感效应。与常规针刺相比，穴位埋线对腧穴的刺激更强且针感更为持久。羊肠线被机体吸收后，作为异体蛋白亦激发了机体的应激能力和免疫功能[13]。多项临床研究显示[14-15]，穴位埋线可有效修复肠黏膜损伤，减轻炎症反应，对UC患者具有良好疗效。现代研究亦证实[16]，穴位埋线能够改善肠道蠕动和肠血流，具有促进溃疡修复的作用。温淑婷等[17]通过数据挖掘系统分析了近15年来穴位埋线治疗UC的选穴规律，发现“足三里”“天枢”“大肠俞”使用频次最高。天枢是大肠经的募穴，能够调畅肠腑、化瘀活血，为治疗肠道疾患的首选腧穴。大肠俞为大肠经背俞穴，与天枢俞、募配伍，通行大肠腑气以达到止泻目的。上巨虚为大肠经下合穴，与天枢穴合募相配，可起到调肠和胃作用。足三里有温胃健脾、和中止泻之效，又可促进一身气血运行以调理肠胃运化，与上巨虚合用具有调节机体免疫、促进溃疡修复的作用[18-19]。

本研究采用3% DSS水溶液建立UC大鼠模型，选取天枢、大肠俞、上巨虚及足三里穴进行穴位埋线治疗，观察大鼠DAI、CMDI评分，结肠长度及结肠组织病理形态改变以评价穴位埋线对UC肠黏膜的修复作用。研究结果提示，经穴位埋线治疗后，UC大鼠DAI和CMDI评分显著降低，结肠长度明显增长，有效改善了大鼠结肠黏膜水肿、充血和炎性细胞浸润，溃疡明显愈合。表明穴位埋线对UC肠黏膜损伤具有显著的抗炎修复作用。

UC患者普遍可见肠黏膜持续性炎症反应，多数研究认为，炎症介质的过度释放在UC发病和转归过程中发挥重要调节作用[20]。NLRP3是目前研究最为深入的炎症体，由招募接头蛋白ASC、效应分子caspase-1和NLRP3所构成，活化的NLRP3可促进炎症介质IL-18和IL-1β的表达，在UC发展中起到促炎作用[5]。而IL-27是近年发现的IL-12家族细胞因子，在炎症进程中具有抗炎和促炎的双重调节作用。炎症初期IL-27能够产生 IFN-γ、IL-18等炎性因子来促进炎症反应，炎症进展过程中，IL-27又可通过上调抑炎因子的表达来达到抗炎效应[21-22]。在自身免疫性脑脊髓炎中，IL-27能够促进免疫调节分子CD39的表达，降低细胞外ATP浓度，进而下调NLRP3炎症小体的核苷酸依赖性激活[23]。有研究证实[6]，DSS诱导的小鼠UC模型中，IL-27可通过抑制NLRP3和caspase-1的活化，进而下调IL-18和IL-1β的表达，发挥对UC炎症的缓解作用。本研究中，UC大鼠血清IL-18、IL-1β和IFN-γ炎症因子的水平均明显升高，IL-27的水平显著降低，穴位埋线治疗后IL-27的水平明显提高，同时抑制了IL-18、IL-1β、IFN-γ水平的升高。Western-blot和RT-RCR结果显示，UC大鼠结肠组织中NLRP3和caspase-1蛋白和mRNA表达均显著上调，而IL-27的表达水平与NLRP3、caspase-1呈现负相关。经穴位埋线治疗后，IL-27表达明显升高，同时显著降低了NLRP3、caspase-1的表达水平。提示穴位埋线对IL-27表达的上调及对NLRP3激活的抑制可能是其发挥对UC抗炎保护作用的重要机制。

综上所述，本研究表明穴位埋线对DSS所诱导的UC模型大鼠具有明显的治疗作用，其机制可能是通过上调IL-27的表达来抑制NLRP3激活，从而减少炎性细胞因子的生成，减轻炎症反应，从而发挥对UC肠黏膜损伤的修复作用。