发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道结构、肠组织基因表达及肠道菌群的影响

何维敏，况世昌，李筱雯，王纯，崔卫涛，王喜亮，肖运才，李自力，周祖涛

（1.华中农业大学动物医学院/湖北省预防兽医学重点实验室，武汉 430070；2.湖北华大瑞尔科技有限公司/生物发酵制剂湖北省工程研究中心，武汉 430070）

肠道具有皱襞、绒毛和微绒毛等结构，是动物机体重要的功能性器官，除具有消化食物、吸收营养的功能，还具有防止外界病原、毒素等有害物质侵入的肠屏障功能［1］。肠道主要通过3个屏障来保护机体免受病原的感染，分别是黏膜屏障、微生物屏障和免疫屏障［2］。肠黏膜屏障又由肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接和菌膜构成［3］。肠道菌群对肠道屏障有较大影响，肠道菌群加速肠上皮细胞更新，改善肠道形态结构；与肠上皮细胞相互作用促进上皮细胞合成和分泌抗菌肽［4］；参与调节分泌肠道免疫活性因子抵御致病菌［5］。仔猪自然断奶时间为17周龄，集约化养殖将仔猪断奶时间提前至3～4周龄。当断奶发生时，仔猪饲喂环境发生巨大变化，出现食欲下降、生长减缓、免疫力下降、腹泻甚至死亡，上述变化称为早期断奶综合征即断奶应激。断奶应激对仔猪的影响主要集中于肠道，主要表现为对肠道结构、肠道微生物和肠道免疫的影响［4］。研究表明，在仔猪饮水中加入复方中药制剂能够改善仔猪的生长性能，提高仔猪免疫力，缓解断奶应激症状［6］。微生态制剂具有黏附作用和竞争性抑制作用，与病原菌抢占肠道黏膜的结合位点，抑制其繁殖，发挥屏障功能［7］。

本试验将发酵中药微生态制剂（组方：白术、白芍、党参、茯苓）和微生态制剂联合添加在断奶仔猪日粮中，测定仔猪肠道结构、肠组织基因表达和肠道菌群变化，为微生态制剂在缓解仔猪断奶应激中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

发酵中药微生态制剂：经薄层色谱鉴定合格的发酵中药合剂，主要成分：白术、白芍、党参、茯苓，由湖北华大瑞尔科技有限公司提供。

微生态制剂：枯草芽孢杆菌TL，有效活菌数2.0×1011CFU/g，由湖北华大瑞尔科技有限公司提供。

1.2 试验动物与试验设计

选取23日龄断奶、平均体重为（7.744±0.446）kg的杜长大三元杂交健康仔猪120头，随机分为4个组：对照组（基础日粮）、抗生素组（基础日粮+0.075 g/kg金霉素+0.015 g/kg恩拉霉素+0.1 g/kg喹乙醇）、试验Ⅰ组（基础日粮+0.3%发酵中药微生态制剂+0.15 g/kg枯草芽孢杆菌TL）、试验Ⅱ组（基础日粮+0.3%发酵中药微生态制剂+0.3 g/kg枯草芽孢杆菌TL），每组3个重复，每个重复10头仔猪。饲喂时间为仔猪保育阶段，具体从23日龄开始到52日龄结束，共30 d。

1.3 试验日粮

仔猪前期乳猪料和后期仔猪料由湖北加益加生物科技有限公司提供，其乳猪料为粉料，仔猪料为颗粒料。每天饲喂前将抗生素、发酵中药微生态制剂和微生物制剂分别与基础日粮充分混合后投入使用，保证现配现用。

1.4 饲养管理

试验于3—4月进行。在仔猪断奶后第1周饲喂乳猪料，断奶后第8～11天将乳猪料和仔猪料分别按照4∶1、3∶2、2∶3、1∶4的比例进行混合饲喂，逐步将乳猪料过渡到仔猪料。每天饲喂仔猪4次，时间分别是8：00、12：00、16：00和20：00，计量不限料（以料槽无剩余料为原则）并按栏记录饲料投喂量；采用鸭嘴式自动饮水器，自由饮水。期间免疫接种程序按规模化猪场养殖程序进行。

1.5 指标测定

1.5.1 肠道形态结构的测定试验结束后，各组分别选取3只仔猪，屠宰，从十二指肠、空肠和回肠中段小心切取约2 cm长的组织样品，石蜡包埋切片后进行苏木素-伊红（HE）染色封片，使用日本Nikon 80i生物光学显微镜并结合NIS-Elements高清晰度彩色图文分析系统进行观察、取图和拍照，测定10根完整绒毛髙度（VH）和隐窝深度（CD），并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（VH/CD）。

1.5.2 肠组织基因表达水平的测定分别提取十二指肠和空肠组织RNA，以组织中β-actin为内参基因，RT-PCR检测十二指肠和空肠中黏蛋白MUC2、紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA表达水平，PCR引物如表1所示。

表1 基因PCR引物

1.5.3 肠道菌群的测定各组分别选取3只仔猪，分别取盲肠内容物，使用Aidlab粪便基因组DNA快速提取试剂盒提取盲肠内容物DNA。qRT-PCR法检测盲肠内容物中大肠杆菌和乳酸杆菌含量，方法参考Chiang等［11］和Walter等［12］。每个样品3个重复，根据标准曲线计算定量结果。

1.6 数据分析

试验数据用Excel 2007软件初步处理，再用SPSS 19.0软件进行统计分析。试验数据经方差同质性和正态性检验，满足条件后进行方差分析。利用ONE-WAY ANOVA、LSD进行差异显著性检验，在差异显著基础上用Ducan法做多重比较，试验结果以“平均值±标准差（x±S）”形式表示，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道形态的影响

发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道形态的影响结果见表2。由表2可知，与对照组、抗生素组和试验Ⅱ组相比，试验Ⅰ组的十二指肠VH/CD值分别提高32.27%、4.26%和8.60%，差异极显著（P＜0.01）。

表2 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道形态的影响

空肠肠道形态结果表明，与对照组相比，抗生素组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组肠绒毛高度分别提高了20.23%（P＜0.01）、24.23%（P＜0.01）和12.43%（P＜0.01），其隐窝深度则分别降低了6.23%（P＜0.01）、9.49%（P＜0.01）和11.69%（P＜0.01），VH/CD值分别提高了28.23%（P＜0.01）、37.23%（P＜0.01）和27.31%（P＜0.01）。试验Ⅰ组VH/CD值比抗生素组提高了7.02%（P＜0.01）。

回肠肠道形态结果表明，与对照组和抗生素相比，试验Ⅰ组VH/CD值分别提高了56.44%（P＜0.01）和43.83%（P＜0.01），试验Ⅱ组VH/CD值则分别提高了36.89%（P＜0.01）和25.86%（P＜0.01）。试验Ⅰ组与试验Ⅱ组比，VH/CD值提高14.28%（P＜0.01）。

2.2 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道基因表达量的影响

发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道基因表达量的影响结果见图1、图2。由图1可知，与对照组相比，抗生素组和试验Ⅰ组MUC2基因mRNA表达上调，试验Ⅱ组下调（P＞0.05）。抗生素组和试验Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），与试验Ⅱ组差异显著（P＜0.05），试验Ⅰ组效果优于试验Ⅱ组。

图1 肠道黏蛋白MUC2基因表达量

由图2可知，与对照组相比，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组十二指肠胞质蛋白ZO-1基因mRNA表达水平上调（P＞0.05），但跨膜蛋白Occludin基因mRNA表达水平都下调（P＞0.05）。与对照组相比，试验Ⅱ组空肠胞质蛋白ZO-1基因表达上调（P＞0.05），试验Ⅰ组空肠跨膜蛋白Occludin基因表达上调（P＞0.05），试验Ⅱ组Occludin基因表达下调（P＞0.05）。

图2 小肠紧密连接蛋白ZO-1基因和Occludin基因mRNA表达量

2.3 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道菌群的影响

大肠杆菌、乳酸杆菌qRT-PCR标准曲线见图3。大肠杆菌K88标准曲线为y=-5.101 0x+55.960，R2为0.998 0；乳酸杆菌标准曲线为y=-3.841 1x+46.305，R2为0.997 8，符合试验要求，说明标准曲线构建成功。

图3 大肠杆菌K88和乳酸杆菌标准曲线

发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道菌群的影响结果见表3。由表3可知，抗生素组和试验Ⅰ组中大肠杆菌数量较低，但与对照组相比差异均不显著（P＞0.05）。试验Ⅰ组乳酸杆菌数量均提高，较对照组和抗生素组提高21.22%（P＜0.05）和33.70%（P＜0.01），试验Ⅱ组乳酸杆菌数量高于抗生素组（P＜0.05），但与对照组差异不显著（P＞0.05）。

表3 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道菌群的影响

3 讨论

3.1 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道结构的影响

小肠是机体消化和吸收的主要部位，肠壁形态结构的完整性是影响肠道健康和机体消化吸收的关键。肠道功能与绒毛高度和隐窝深度密切相关。小肠绒毛是肠上皮和固有层向肠腔内突而成，与小肠柱状细胞表面的微绒毛，扩大了黏膜表面积，增加了小肠与养分之间的接触面积，能有效促进养分的消化和吸收，故绒毛长度增长，表示肠道营养吸收功能也会提高。肠隐窝又称小肠腺，是相邻绒毛根部的上皮向固有层内凹所形成的管状腺体，在隐窝中下部的干细胞能不断分裂增殖，产生的子细胞向上迁移至绒毛顶端，并分化成熟来补充绒毛上皮顶端凋亡脱落的吸收细胞和杯状细胞［13］。隐窝变浅表示细胞凋亡速度减缓，肠上皮细胞成熟率上升，绒毛形态正常。绒毛和隐窝比值反映小肠营养物质消化吸收功能的综合性指标，其比值越大，表明小肠的消化吸收功能越强［14］。

刘惠［15］将中草药复合粗多糖应用于断奶仔猪后可较大程度提高其小肠绒毛高度和VH/CD值。殷超［16］用由黄芪、黄芩、黄柏、党参等中药提取物所组成的中草药复方制剂作用于断奶仔猪后能显著增加小肠绒毛高度，降低了隐窝深度。仔猪早期断奶应激会使肠绒毛高度下降、隐窝深度加深。本试验在断奶仔猪日粮中添加中药微生态制剂和抗生素可以提高十二指肠、空肠及回肠的绒毛高度和VH/CD值（P＜0.01），降低了各小肠隐窝深度，且中药微生态制剂组效果优于抗生素组，表明中药微生态制剂在保护断奶仔猪小肠的正常结构、促进肠道形态发育、增强机体对营养物质的消化吸收等方面有重要作用。

3.2 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠组织基因表达的影响

MUC2是跨膜糖蛋白分子，是黏液细胞分泌的主要黏蛋白，能形成弹性的胶体状覆盖物，保护黏膜免受物理、化学、病原微生物等各种有害因素的损伤，并参与细胞间的黏附及信号转导，对细胞生长、发育、增殖和分化，维持细胞完整性等过程有显著影响，是消化道内先天性免疫屏障的重要组成部分。紧密连接（TJ）作为细胞间最重要的连接方式，位于肠上皮细胞膜外侧的顶部，主要由ZO-1、Occludin、Claudins 3种蛋白构成，与肠上皮细胞共同形成动态的选择性通透屏障（机械屏障），在阻止病原体等有害物质进入机体的同时，允许营养物质进入体内，对维持肠道上皮屏障功能的完整性及肠上皮细胞的极性和通透性具有重要作用［17，18］。王元心［19］研究发现益生菌有促进黏蛋白MUC2的分泌，升高mRNA表达水平的作用，有利于增强雏鸡黏膜免疫屏障的防御功能。本研究中，与对照组相比，抗生素组和中药微生态制剂Ⅰ组空肠中MUC2基因mRNA表达水平上调，中药微生态制剂Ⅱ组与对照组差异不显著（P＞0.05），说明中药微生态制剂和抗生素可以增加仔猪肠道MUC2的表达量，增强肠道的化学屏障功能。研究表明，紧密连接蛋白质的高表达可维持肠黏膜机械屏障的完整性，对维持断奶仔猪肠黏膜通透性和阻止有害物质入侵起重要作用［20，21］。

本研究发现试验Ⅱ组断奶仔猪十二指肠和空肠ZO-1基因表达上调（P＞0.05），Occludin基因表达略下调（P＞0.05）；中药微生态制剂Ⅰ组断奶仔猪十二指肠中ZO-1基因表达上调（P＞0.05），Occludin基因表达略下调（P＞0.05），空肠中ZO-1基因表达略下调（P＞0.05），Occludin基因表达上调（P＞0.05），其原因还需进一步探究。

3.3 发酵中药微生态制剂对断奶仔猪肠道菌群的影响

动物在健康情况下肠道内微生物菌群维持平衡状态，断奶后仔猪在饮食、饲养等方面发生剧烈变化，易诱发由断奶应激导致的肠道微生物菌落紊乱、失衡，使得大肠杆菌等有害菌数量增加，乳酸杆菌等有益菌数量减少，导致仔猪肠道屏障能力迅速降低，极易诱发各种疾病［22］。韩剑众等［23］研究发现由黄芪、当归、茯苓、柴胡和大黄等中药的有效成分组成的合剂能明显提高断奶仔猪盲肠内乳酸杆菌和双歧杆菌的含量，降低大肠杆菌的含量。宋良敏［24］用枯草芽孢杆菌、粪肠球菌等制成的复合微生态饲料添加剂，添加到断奶仔猪日粮中，发现肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的数量增多，大肠杆菌的数量减少。本研究发现在断奶仔猪日粮中添加抗生素在降低大肠杆菌数量的同时，显著抑制了乳酸杆菌的生长，而联用发酵中药微生态制剂和微生态制剂，不仅能抑制大肠杆菌的增殖，还促进了乳酸杆菌的生长，且试验Ⅰ组效果要优于试验Ⅱ组。

4 结论

在断奶仔猪日粮中添加0.3%发酵中药微生态制剂和0.15 g/kg枯草芽孢杆菌TL，可提高十二指肠、空肠和回肠VH/CD值，促进盲肠内容物乳酸杆菌繁殖，降低盲肠内容物大肠杆菌数量，但对肠道基因表达作用不明显。