淫羊藿苷与盐酸米诺环素联合应用的抗菌及促成骨性能研究

刘宁 林媛 韩林艺 胡思雨 王一钦 何虹洁

种植体周围炎是导致种植体修复失败的主要原因之一。目前，普遍认为种植体周围炎是由菌斑聚集引发的感染性疾病，炎症突破软组织封闭导致种植体周围骨组织吸收，患病率约为14%～30%[1]。因此，种植体周围炎的治疗应注重缓解炎症的同时促进骨再生。淫羊藿苷(icariin，ICA)是从中药淫羊藿中提取的一种黄酮类化合物，是淫羊藿的主要活性成分之一。已有研究表明，淫羊藿苷对促进骨再生、抑制骨吸收、减轻炎症反应、调节免疫反应等方面具有明显作用[2-3]。盐酸米诺环素(minocycline hydrochloride，MH)是目前临床上种植体周围炎局部治疗的常用抗生素药物[4]。已有研究证实，中药与抗生素联合应用可提高抗生素的治疗效果，减少不良反应，甚至可以逆转细菌对一些抗生素的耐药性[5]。ICA与MH联合应用对种植体周围炎致病菌及骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作用的研究尚未见报道。本研究旨在探究ICA与MH联合应用对种植体周围炎致病菌的抑菌作用及对BMSCs成骨分化的影响，为种植体周围炎的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

淫羊藿苷(散剂，MedChemExpress，德国)；盐酸米诺环素(胶囊剂，浙江杭州瀚晖制药有限公司)；脑心浸液培养基(BD，美国)；α-MEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液(Hyclone，美国)；Cell Counting Kit-8(CCK-8，Dojindo Laboratories，日本)；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(上海碧云天)；茜素红(苏州赛业)；Trizol、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、FastStart Universal SYBR Green Master、LightCycler qPCR分析仪、荧光定量PCR分析仪(Roche，瑞士)；酶标仪(BioTek，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养 取冻存的牙龈卟啉单胞菌(Pg，ATCC33277)和具核梭杆菌(Fn，ATCC10953)菌株涂于含有 10%无菌脱纤维羊血的BHI培养板中(加氯化血红素和维生素K)，置于37 ℃厌氧箱内培养。复苏成功后挑取单菌落涂布于新的脑心浸液培养基(brain heart infusion,BHI)琼脂培养板上。待平板上形成形态均一的菌落后，挑取单克隆菌落接种至 BHI液体培养基中进行增菌培养。麦氏比浊法比浊，用BHI液体培养基将菌液稀释配制成浓度1.0×107CFU/mL 的菌悬液备用。

1.2.2 ICA与MH体外联合用药实验 采用微量方阵棋盘法设计，在96 孔板横纵两个方向上交差加入ICA和MH，ICA的终浓度为1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L，MH的终浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μg/mL，菌悬液终浓度为 1×106CFU/mL，并设置菌液对照组和药液对照组，轻轻震荡后，置于37 ℃厌氧箱内培养48 h后，酶标仪于波长600 nm测定每孔样本A值。计算抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)，FICI=ICA联合时MIC/ICA单用时MIC+MH联合时MIC/MH单用时MIC，FICI≤0.50 为协同作用，0.502.00为拮抗作用[6]。

1.2.3 细胞培养 SD大鼠BMSCs为本实验室冻存。使用含有1%青霉素、链霉素，10%胎牛血清的α-MEM培养液在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d更换培养液，待细胞达到70%～80%汇合时，进行传代培养。

1.2.4 CCK-8实验 96 孔板每孔接种3×103个BMSCs细胞，置于培养箱中培养24 h后，更换培养液。分别加入含有不同浓度ICA(1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)和MH(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μg/mL)的α-MEM培养液，并设立不加药物的培养液对照组和无细胞的空白组，每组设置3 个复孔。在药物加入后的0、1、3、5、7 d更换孔内培养基为含10% CCK-8的无血清α-MEM培养液，继续培养3 h后，酶标仪于波长450 nm测定样本A值。

1.2.5 ALP活性检测 24 孔板每孔接种0.5×104个BMSCs细胞，置于培养箱中培养24 h后，更换培养液，药液分组同1.2.4。第3天换1 次培养液，培养7 d后，PBS漂洗，加入0.1% Triton X-100，37 ℃条件下裂解30 min，离心后按照ALP活性检测和BCA蛋白定量试剂盒操作说明进行操作，计算各组ALP活性及蛋白含量。

1.2.6 RT-PCR分析 6孔板每孔接种1×105个BMSCs细胞，置于培养箱中培养24 h后，更换培养液。分别加入含1×10-7mol/L ICA、1×10-8mol/L ICA、1 μg/mL MH、1×10-7mol/L ICA+1 μg/mL MH、1×10-8mol/L ICA+1 μg/mL MH的α-MEM培养液，并设立不加药物的培养液对照组，每组设置3 个复孔。第3天换1 次培养液，培养7 d后，PBS漂洗，使用TRIzol提取细胞总RNA，按照cDNA 反转录试剂盒的反转录体系进行反转录。配制SYBR Green qPCR反应体系后，于LightCycler qPCR仪器中进行检测，以GAPDH为内参，对成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、Col-1进行RT-PCR 分析。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列表

1.2.7 茜素红染色及钙含量半定量分析 24 孔板每孔接种0.5×104个BMSCs细胞，置于培养箱中培养24 h后，更换含成骨诱导液的培养液，药液分组与1.2.6 RT-PCR分析实验相同。每3 d换1 次培养液，培养21 d后，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗，加入茜素红染液染色30 min，再次用PBS漂洗，在显微镜下观察拍照。拍照完成后，每孔加入10% 氯化十六烷基吡啶0.5 mL，待钙结节溶解后，移液至96 孔板中，酶标仪于波长570 nm测定样本A值，以对照组为基准，对矿化程度进行半定量分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。数据进行正态性检验和方差齐性检验后，使用单因素方差(one-way ANOVA)分析，两两比较采用LSD法检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 ICA联合MH的微量方阵棋盘实验

检测浓度范围内单药ICA对P.gingivalis的MIC为1×10-4mol/L,对F.nucleatum无抑菌作用。ICA和MH联合应用能有效降低MH的MIC浓度，联合应用对P.gingivalis表现出协同作用，对F.nucleatum表现出相加作用(表2)。

表2 微量方阵棋盘实验结果

2.2 ICA和MH对BMSCs增殖的影响

第1、3、5、7天，相比于完全培养液对照组，检测浓度范围内的ICA和MH均具有促进BMSCs增殖的作用(P<0.05)。在第7天，1×10-8mol/L ICA对BMSCs促增值的作用最强，除1×10-9mol/L ICA外，与其它浓度ICA相比差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A)。在第7天，1 μg/mL MH对BMSCs促增值的作用最强(P<0.05)(图1B)。

图1 ICA和MH对BMSCs增殖的影响

2.3 ICA和MH对ALP活性的影响

培养7 d后，1×10-7mol/L ICA显著增强BMSCs的ALP活性(P<0.05)(图2A)。0.062 5、0.125、0.25和1 μg/mL MH均具有增强ALP活性的作用(P<0.05)(图2B)。

图2 ICA和MH对BMSCs中ALP活性的影响

2.4 成骨分化相关mRNA检测

培养7 d后，ICA和MH联合应用组的Runx2和OCN mRNA表达水平显著高于其它各组(P<0.05)。与1 μg/mL MH单独应用组相比，联合应用组的ALP表达与其差异有统计学意义，1×10-7mol/L ICA+1 μg/mL MH组的Col-1表达与其差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图3 ICA和MH联合应用对BMSCs中成骨分化相关mRNA表达水平的影响

2.5 茜素红染色及钙含量半定量分析

成骨诱导培养21 d，各组细胞茜素红染色镜下均观察到红色矿化结节，外围呈橘红色，中心呈红棕色。ICA和MH联合应用组的矿化结节相对较大，数量较多(图4)。钙含量半定量分析结果显示，1×10-7mol/L ICA+1 μg/mL MH组的钙含量显著高于其余各组(P<0.05)(图5)。

图4 各组BMSCs茜素红染色

图5 各组BMSCs中钙含量半定量分析

3 讨 论

种植体周围炎所致的骨缺损是导致种植体修复失败的重要原因。种植体周围炎的发生与种植体龈下微生物菌群中的一些致病菌数量迅速增加密切相关，多种致病菌间的相互作用促进了种植体周围炎的发生[7-8]。ICA是从中药淫羊藿的主要有效成分，属于黄酮苷类。已有研究表明，淫羊藿水提物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌表现出抑菌活性[9]，ICA与氨苄西林联合使用可提高抗菌药对耐药金黄色葡萄球菌的抑制效果[5]，并且ICA对被高剂量万古霉素抑制的成骨细胞具有促成骨特性，ICA有助于骨感染后的治疗[10]。然而，对种植体周围炎主要致病菌作用的相关报道较少，种植体周围炎是一个混合厌氧感染，且微生物组成与慢性牙周炎龈下菌斑类似[11]。P.gingivalis是种植体周围炎红色复合体致病菌中检出率最高的龈下致病优势菌，是生物膜的晚期定植菌[12]。F.nucleatum可以与口腔许多细菌发生共聚，是生物膜早期定植菌和晚期定植菌共聚的连接桥，P.gingivalis和F.nucleatum与种植体周围炎和牙周炎的发生密切相关[12-13]。因此，本研究选取这两个菌种对ICA和MH联合应用的抑菌性能进行实验研究。

研究结果显示，检测浓度范围内1×10-2～1×10-9mol/L，单药ICA对P.gingivalis具有抑制作用，对F.nucleatum无抑制作用，MH对P.gingivalis和F.nucleatum均具有抑制作用，ICA和MH联合应用对P.gingivalis表现出协同抑制作用，对F.nucleatum表现出相加抑制作用。文献报道，MH通过附着在细菌30S核糖体亚基上阻止蛋白质合成，从而抑制细菌生长[14]。ICA与抗生素联合应用增强对细菌的抑制作用可能是通过对黄酮类化合物主要结构的改变和修饰实现的[15]。本实验结果表明ICA对部分种植体周围炎治病菌具有抑制效果，ICA和MH联合应用可增强抑菌效果，减少MH的药物用量。

BMSCs在体外向成骨细胞方向诱导分化时，主要经历以下几个阶段：转化期、细胞增殖期、细胞聚集分泌期、细胞外基质钙化期[16]。本研究选择大鼠的BMSCs，检测ICA和MH对细胞增殖、ALP活性、成骨分化相关基因mRNA的表达和细胞矿化的作用。CCK-8实验结果显示检测范围内不同浓度的ICA和MH对BMSCs的增殖均具有促进作用，其中1×10-8mol/L ICA 和1 μg/mL MH对BMSCs促增值的作用最强(P<0.05)。ALP是一种钙结合转运蛋白，促进细胞成熟、钙化，可作为一个衡量BMSCs向成骨细胞分化的早期重要标记物[17]。本研究的结果显示，1×10-7mol/L ICA显著增强BMSCs的ALP活性，0.062 5、0.125、0.25和1 μg/mL MH对BMSCs的ALP活性均具有增强作用(P<0.05)。有研究报道，适宜抑菌浓度的MH能促进成骨细胞增殖和ALP活性表达[18]，这与本研究结果相似。MH促进ALP活性的原因可能是MH通过上调ALP和Runx2 mRNA表达水平，从而促进ALP的分泌。根据细胞增殖和ALP活性实验结果，选用1×10-8、1×10-7mol/L ICA和1 μg/mL MH作为后续两种药物联合应用对BMSCs促成骨分化作用实验研究的药物浓度。

本研究采用RT-PCR实验检测两种药物联合应用对成骨相关因子Runx2、ALP、OCN和Col-1 mRNA表达水平的影响。实验结果显示相比于1 μg/mL MH单独应用组，1×10-7mol/L ICA 和1 μg/mL MH联合应用组Runx2、ALP、OCN和Col-1 mRNA的表达水平均显著增高(P<0.05)。茜素红染色结果显示ICA 和MH联合应用组的矿化结节数量相对较多。钙含量半定量分析结果显示，1×10-7mol/L ICA和1 μg/mL MH联合应用组的钙含量显著高于其余各组(P<0.05)。以上实验结果显示，ICA与MH联合应用可以增强对BMSCs促成骨分化效果，其中1×10-7mol/L ICA和1 μg/mL MH联合应用促进BMSCs成骨分化效果最强。研究表明ICA可通过多种信号通路刺激BMSCs向成骨细胞分化，包括骨形态发生蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、一氧化氮和典型的Wnt/β-catenin信号通路[19]。MH是一种已知的钙螯合剂，能够调节细胞微环境中的钙水平。钙信号通路在成骨分化过程中起着重要作用，推测MH通过影响钙介导的信号转导，改变细胞内外钙水平，从而通过Smad-和Ras-介导的信号通路调节成骨分化过程[20]。本研究结果表明ICA和MH联合应用可促进成骨相关因子Runx2和OCN mRNA的表达，但还需要通过更多的体内外实验进一步探究ICA与MH联合应用对BMSCs作用的分子机制，以及对种植体周围炎治疗的效果。

综上所述，本研究通过体外实验证实ICA与MH联合应用可提高MH对P.gingivalis和F.nucleatum的抑制效果和对BMSCs促成骨分化效果。本研究初步探讨ICA和MH联合应用对种植体周围炎致病菌和对间充质干细胞的作用，为种植体周围炎的治疗提供新思路。