阿尔泰金莲花总黄酮通过miR-23b-3p抑制RSV感染支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的分子机制研究

尚耀民，邢宝春✉，胡旭，周晓蕾，梁瑞霞，张一

（1.河南省胸科医院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

呼吸道合胞病毒（RSV）是引起下呼吸道感染的主要病原体，可引起病毒性肺炎，其中支气管上皮细胞是RSV感染的主要场所。RSV感染呼吸道上皮细胞后诱导细胞产生大量细胞因子，引起上皮细胞损伤，诱导气道上皮屏障功能出现障碍，从而导致支气管炎、肺炎、哮喘等呼吸道疾病的发生［1-4］。目前针对RSV感染尚无安全有效的特异性防治措施及特效药物，而研究表明中医药对呼吸道病毒的抑制作用明显，可减轻炎症反应，改善肺功能［5-6］。阿尔泰金莲花是毛茛科金莲花属多年生草本植物，金莲花与其是同属植物，其所含的黄酮类成分有抗氧化、抗炎、抗病毒的活性［7-8］。研究发现，阿尔泰金莲花总黄酮提取物可能通过抑制炎症反应、抗氧化损伤对大气细颗粒物（PM2.5）诱导的BEAS-2B 细胞急性损伤具有一定的保护作用［9］。阿尔泰金莲花总黄酮对PM2.5 致大鼠肺纤维化也有一定的防治作用［10］。但阿尔泰金莲花总黄酮对RSV 感染支气管上皮细胞分子机制尚不清楚。研究发现，重症肺炎患儿中miR-23b-3p 低表达［11］，miR-23b-3p 靶向PALM3 抑制肺炎链球菌诱导的A549 细胞损伤［12］，说明miR-23b-3p 与肺部炎症反应有关。本实验旨在研究阿尔泰金莲花总黄酮对RSV 感染支气管上皮细胞凋亡和炎症反应的影响及是否与miR-23b-3p 有关，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人支气管上皮细胞16-HBE、呼吸道合胞病毒（RSV）（深圳市豪地华拓生物科技有限公司）；DMEM培养基（江苏齐氏生物科技有限公司，批号：CB3955688）；CCK-8 试剂盒（批号：CA1210）、凋亡检测试剂盒（批号：G1120）（北京索莱宝科技有限公司）；蛋白裂解液（上海贝博生物科技有限公司，批号：BB-3201）；TNF-α ELISA 试剂盒（批号：E-EL-H0109c）、IL-6 ELISA 试剂盒（批号：E-EL-H6156）、IL-1α ELISA 试剂盒（批号：E-EL-H0088c）（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；荧光定量PCR试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，批号：FP402-02］。

1.2 阿尔泰金莲花总黄酮的制备

阿尔泰金莲花药材购自新疆药材市场。取适量干燥阿尔泰金莲花药材，加30倍体积70%乙醇，加热、回流2 次，1.5 h/次，收集2 次滤液，蒸干后用培养基定容，配置成实验所需浓度备用。

1.3 细胞处理与分组

16-HBE 细胞用DMEM 培养基常规培养，用呼吸道合胞病毒（RSV）感染16-HBE细胞作为RSV组，正常培养的细胞作为NC 组；分别用8.0、16.0、32.0 µg/mL的阿尔泰金莲花总黄酮处理RSV 感染的16-HBE 细胞，记为RSV+低、中、高剂量组；将miR-23b-3p 模拟物及阴性对照转染至RSV 感染的16-HBE 细胞，记为RSV+miR-23b-3p 组、RSV+miR-NC 组；将miR-23b-3p 抑制剂及阴性对照转染至RSV 感染的16-HBE 细胞后用32.0 µg/mL 的阿尔泰金莲花总黄酮处理，记为anti-miR-23b-3p+RSV+高剂量组、anti-miR-NC+RSV+高剂量组。

1.4 CCK-8检测细胞活性

各组培养48 h 细胞，加10 µL CCK-8 试剂，孵育2 h，酶标仪检测各组细胞450 nm吸光度值（A）。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞培养48 h，预冷PBS漂洗，与500µL的结合缓冲液混匀；先加10µL Annexin V-FITC，再加5µL PI，避光孵育10 min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 Western blot法检测蛋白表达

提取细胞总蛋白，定量后进行SDS-PAGE，转移至PVDF，封闭后加CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax一抗，4 ℃孵育过夜，加二抗室温孵育2 h，曝光显影，定影，测定蛋白条带的灰度值。

1.7 ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1α水平

各组细胞培养48 h后取上清测定TNF-α、IL-6、IL-1α水平，具体按照试剂盒操作进行检测。

1.8 RT-qPCR法检测miR-23b-3p表达水平

提取细胞总RNA，反转录成cDNA，进行PCR 扩增，每个样品重复3次，相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-23b-3p 上游引物：5'-CAGGCAAGATGCTGTT GCA-3'，下游引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGA CTC-3'。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活性和凋亡情况比较

RSV 组细胞活性较NC 组降低，凋亡率较NC 组升高（P＜0.01）；RSV+低、中、高剂量组细胞活性较RSV组升高，凋亡率较RSV组降低（P＜0.01）。见图1，表1。

表1 各组细胞活性和凋亡情况的比较（±s）

表1 各组细胞活性和凋亡情况的比较（±s）

注：与NC组比较，*P ＜0.01；与RSV组比较，#P ＜0.01。

凋亡率（%）8.04±0.61 23.94±2.06**17.93±1.51##11.86±1.02##8.94±0.73##组别NC组RSV组RSV+低剂量组RSV+中剂量组RSV+高剂量组n 9 9 9 9 9 A值1.083±0.09 0.536±0.05**0.691±0.06##0.836±0.08##1.061±0.10##

2.2 各组细胞相关蛋白表达情况比较

RSV 组CyclinD1 表达水平较NC 组降低，Cleaved Caspase-3、Bax 表达水平较NC 组升高（P＜0.01）；RSV+低、中、高剂量组CyclinD1 表达水平较RSV 组升高，Cleaved Caspase-3、Bax 表达水平较RSV 组降低（P＜0.01）。见图2，表2。

表2 各组细胞相关蛋白表达的比较（±s）

表2 各组细胞相关蛋白表达的比较（±s）

注：与NC组比较，**P ＜0.01；与RSV组比较，##P ＜0.01。

组别CyclinD1 Bax NC组RSV组RSV+低剂量组RSV+中剂量组RSV+高剂量组n 9 9 9 9 9 0.32±0.03 0.72±0.07**0.61±0.05##0.45±0.04##0.40±0.04##0.83±0.08 0.39±0.03**0.51±0.05##0.68±0.06##0.80±0.08##Cleaved Caspase-3 0.44±0.04 0.93±0.09**0.81±0.07##0.65±0.06##0.48±0.04##

2.3 各组细胞炎症因子表达情况比较

RSV 组TNF-α、IL-6、IL-1α 水平较NC 组升高（P＜0.01）；RSV+低、中、高剂量组TNF-α、IL-6、IL-1α水平较RSV组降低（P＜0.01）。见表3。

表3 各组细胞炎症因子表达的比较（±s）

表3 各组细胞炎症因子表达的比较（±s）

注：与NC组比较，**P ＜0.01；与RSV组比较，##P ＜0.01。

IL-1α（pg/mL）136.94±11.65 248.73±21.04**209.56±16.15##159.75±12.64##124.31±9.68##组别NC组RSV组RSV+低剂量组RSV+中剂量组RSV+高剂量组n 9 9 9 9 9 TNF-α（pg/mL）51.96±4.62 217.93±18.56**176.94±15.33##129.73±11.03##89.67±7.56##IL-6（pg/mL）89.03±8.14 193.66±17.54**154.71±14.03##119.63±10.16##93.24±8.75##

2.4 各组细胞miR-23b-3p表达情况比较

RSV 组miR-23b-3p 表达水平较NC 组降低（P＜0.01）；RSV+低、中、高剂量组miR-23b-3p 表达水平较RSV组升高（P＜0.01）。见表4。

表4 各组细胞miR-23b-3p表达情况比较（±s）

表4 各组细胞miR-23b-3p表达情况比较（±s）

注：与NC组比较，**P ＜0.01；与RSV组比较，##P ＜0.01。

miR-23b-3p 1.00±0.11 0.41±0.04**0.57±0.05##0.72±0.07##0.92±0.09##组别NC组RSV组RSV+低剂量组RSV+中剂量组RSV+高剂量组n 9 9 9 9 9

2.5 miR-23b-3p 对RSV 感染的支气管上皮细胞16-HBE活性，凋亡，蛋白表达和炎症因子水平的影响

RSV+miR-23b-3p 组miR-23b-3p 表达水平、细胞活性和CyclinD1 表达水平较RSV+miR-NC组高，凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表达水平、TNF-α、IL-6、IL-1α 水平较RSV+miR-NC 组低（P＜0.05）。见图3，表5和表6。

表5 miR-23b-3p对RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）活性、凋亡影响（±s）

表5 miR-23b-3p对RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）活性、凋亡影响（±s）

注：与RSV+miR-NC组比较，**P ＜0.01。

组别RSV+miR-NC组RSV+miR-23b-3p组Bax 0.73±0.07 0.35±0.03**n 9 9 miR-23b-3p 1.00±0.10 2.69±0.24**A值0.54±0.05 1.03±0.09**凋亡率（%）23.89±2.11 9.21±0.85**CyclinD1 0.41±0.04 0.79±0.07**Cleaved Caspase-3 0.94±0.09 0.48±0.03**

表6 miR-23b-3p对RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）炎症因子水平的影响（±s）

表6 miR-23b-3p对RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）炎症因子水平的影响（±s）

注：与RSV+miR-NC组比较，**P ＜0.01。

组别RSV+miR-NC组RSV+miR-23b-3p组IL-1α（pg/mL）247.91±22.53 119.14±9.68**n 9 9 TNF-α（pg/mL）218.16±17.59 73.94±6.85**IL-6（pg/mL）194.08±16.91 72.11±7.04**

2.6 anti-miR-23b-3p 对阿尔泰金莲花总黄酮作用的RSV 感染的支气管上皮细胞16-HBE 活性、凋亡和炎症因子水平的影响

anti-miR-23b-3p+RSV+高剂量组miR-23b-3p 表达水平、细胞活性和CyclinD1 表达水平较anti-miR-NC+RSV+高剂量组降低（P＜0.01），凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表达水平、TNF-α、IL-6、IL-1α 水平较anti-miR-NC+RSV+高剂量组升高（P＜0.01）。见图4，表7和表8。

表7 anti-miR-23b-3p对阿尔泰金莲花总黄酮作用的RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）活性、凋亡影响（±s）

表7 anti-miR-23b-3p对阿尔泰金莲花总黄酮作用的RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）活性、凋亡影响（±s）

注：与anti-miR-NC+RSV+高剂量组比较，**P ＜0.01。

组别anti-miR-NC+RSV+高剂量组anti-miR-23b-3p+RSV+高剂量组Bax 0.39±0.04 0.76±0.07**n 9 9 miR-23b-3p 1.00±0.11 0.45±0.04**A值1.06±0.09 0.53±0.05**凋亡率（%）8.91±0.81 22.04±1.96**CyclinD1 0.81±0.08 0.41±0.04**Cleaved Caspase-3 0.47±0.04 0.89±0.08**

表8 anti-miR-23b-3p对阿尔泰金莲花总黄酮作用的RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）炎症因子水平的影响（±s）

表8 anti-miR-23b-3p对阿尔泰金莲花总黄酮作用的RSV感染的支气管上皮细胞（16-HBE）炎症因子水平的影响（±s）

注：与anti-miR-NC+RSV+高剂量组比较，**P ＜0.01。

组别anti-miR-NC+RSV+高剂量组anti-miR-23b-3p+RSV+高剂量组IL-1α（pg/mL）125.03±10.06 233.19±20.01**n 9 9 TNF-α（pg/mL）89.57±8.46 177.36±14.02**IL-6（pg/mL）93.31±8.97 206.03±16.34**

3 讨论

呼吸系统疾病是严重威胁人类生命的常见病、多发病，支气管上皮细胞是机体对外保护的第一道屏障，可以对抗潜在病原体和外来颗粒性引起的损伤，是气道的物理保护壁，支气管上皮细胞损伤可诱导气道炎症，而炎症又可引起气道上皮反复损伤，进而造成呼吸系统疾病的发生［13-15］。中药及其活性成分在一系列肺相关疾病中可抑制感染、炎症［16-17］。研究发现阿尔泰金莲花浸膏粉对PM2.5 致大鼠急性肺损伤有保护作用［18］。金莲花总黄酮提取物对LPS致大鼠急性肺损伤具有保护作用，其机制可能与其抗氧化作用和减少炎症因子的释放有关［19］。本实验结果显示，不同剂量阿尔泰金莲花总黄酮处理后，能增加细胞活性和CyclinD1 表达水平，降低凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表达水平，表明阿尔泰金莲花总黄酮可抑制RSV感染的16-HBE 细胞凋亡，促进细胞存活。TNF-α、IL-6、IL-1α 是促炎细胞因子，其水平升高可促进炎症反应的发生［20-21］。经阿尔泰金莲花总黄酮处理，可降低16-HBE 细胞TNF-α、IL-6、IL-1α 水平，表明阿尔泰金莲花总黄酮可抑制RSV 感染的16-HBE 细胞炎症反应。提示，阿尔泰金莲花总黄酮对RSV 感染的16-HBE细胞损伤具有一定的保护作用。

研究表明miRNA 可参与调控RSV 引起的支气管上皮细胞炎症反应［22］。研究发现皮肌炎患者血清中miR-23b-3p 下调表达，参与皮肌炎的发病过程［23］。过表达miR-23b-3p 可降低类固醇引起的股骨头坏死大鼠促炎细胞因子水平［24］。表明miR-23b-3p 参与炎症反应的发生和发展。本实验结果显示，RSV 感染的16-HBE 细胞中miR-23b-3p 表达水平降低；过表达miR-23b-3p 可升高16-HBE 细胞活性、CyclinD1 表达水平，降低凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表达水平、TNF-α、IL-6、IL-1α 水平，表明过表达miR-23b-3p 抑制RSV 感染的16-HBE 细胞损伤。本实验还发现，阿尔泰金莲花总黄酮可增加miR-23b-3p 水平，而抑制miR-23b-3p 表达可逆转阿尔泰金莲花总黄酮对RSV 感染的16-HBE 细胞活性，凋亡和炎症因子水平的影响。

综上所述，阿尔泰金莲花总黄酮可能通过上调miR-23b-3p 表达抑制RSV 感染的支气管上皮细胞凋亡和炎症反应。