不同发酵工艺对艾叶燃烧产物中黄酮含量的影响★

邢珍闻，师改霞，张新宇，毕润泽，王佳晨，王慧芳，宋永波

（太原工业学院化学与化工系，山西 太原 030008）

引言

黄酮类化合物是一类在自然界广泛分布的多酚类物质，是强抗氧化剂，具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒和调节免疫等功能，因此具有很广泛的应用前景[1-3]。艾叶燃烧后产生的灰烬（即艾灰），在治疗脚气、祛痘、止血、除味、消炎杀菌等方面有极大的功效[4-5]。实验结果表明，艾绒经不完全燃烧后，虽大部分有机物都被分解，但其中仍含有部分黄酮[6]，因此，艾灰的提取物还有抗氧化和清除自由基的作用，可抗癌、抗衰老，对艾灰抗氧化活性物质的研究和利用是有待开发的课题。本文通过研究不同发酵工艺对艾灰中黄酮含量的影响，以提高艾灸产物的利用率。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

数控超声波清洗器，KQ-1OODE 型，昆山市超声仪器有限公司；循环水真空泵，SHZ-DⅢ型，巩义市予华仪器有限公司；752 紫外可见分光光度仪，上海菁华科技仪器有限公司；电子天平，FA2104 型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；压力蒸汽灭菌锅，上海力振科技；恒温振荡器，HZQ-X100A 型。

艾灰；无水乙醇；牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；酵母菌。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮标准曲线的绘制

本实验根据董雨卓、赵馨怡等在文献[7]中的方法，用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定，得到黄酮标准曲线方程[见式（1）]，线性范围：0 mg/mL～0.04 mg/mL，R2=0.992 8。

1.2.2 黄酮的提取

用电子天平准确称量1.0 g 过筛后的艾灰粉末，倒入50 mL 圆底烧瓶，加入体积分数为30%的乙醇53 mL，超声30 min 后再在90 ℃水浴中加热1 h，趁热过滤，弃去滤渣，溶液转移到100 mL 容量瓶中定容。

1.2.3 发酵

取40 mL 黄铜提取液和40 mL 营养肉汤于250 mL锥形瓶中调节pH=5，塞上棉花包上报纸放在高温灭菌锅里灭菌1 h 后取出，然后冷却至室温，用移液枪取1.5 mg 酵母菌菌液进行接种，最后放在37℃的恒温培养箱中培育3 d。

1.2.4 黄酮含量测定方法

取1 mL 提取液于50 mL 容量瓶中，向其中加入50%的乙醇10 mL，加入5%的亚硝酸钠溶液1.0 mL，静置5 min 后，再加入10%的硝酸铝溶液1.0 mL，静置5 min，最后加入4.0 mL 10%的氢氧化钠溶液，用50%的乙醇定容至刻度线处。同时配置除了提取液之外的试剂作空白对照，在510 nm 下测吸光度，由方程计算黄酮得率，再计算出黄酮含量[见式（2）]。

式中：C 为测定样品液的质量浓度，g/mL；V 为测定样品液的体积，mL；Q 为待测液的稀释倍数；W 为艾灰粉末的质量，g。

1.2.5 单因素实验

接种量：准确称取1 g 艾灰，进行黄酮的提取，后在提取液中加入15 mL 无菌水，用5%的HCl 将其pH调节到5，准备5 份。随后用移液枪分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg 不同接种量的酵母菌培养菌液在37 ℃的条件下进行培养，发酵3 d 后将其取出并进行测量，并计算黄酮含量。

温度：准确称取1 g 艾灰后，进行黄酮的提取，后在提取液中加入15 mL 无菌水，用5%的HCl 将其pH 调节到5，准备5 份。随后用移液枪加入分别在20、25、30、35、40 ℃的条件下进行培养，发酵3 d 后将其取出并进行测量，并计算黄酮含量。

发酵天数：准确称取1 g 艾灰后，进行黄酮的提取，后在提取液中加入15 mL 无菌水，用5 %的HCl将其pH 调节到5，准备5 份。随后用移液枪加入前面确定的最佳酵母菌接种量，在前面确定的最佳温度条件下进行培养，分别发酵1、2、3、4、5 d 后将其取出并进行测量，并计算黄酮含量。

料液比：用天平称取1 g 艾灰后，进行黄酮的提取，准备5 份后分别在提取液中加入10、15、20、25、30 mL 的无菌水，用5%的HCl 将其pH 调节到5。随后用移液枪加入前面确定的最佳酵母菌接种量，在前面确定的最佳酵母菌接种量、发酵温度和天数条件下培养，并计算黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 接种量对黄酮含量的影响

由图1 看出，当接种量小于1 mg 时，随着接种量的增大，含量也随之增大，当接种量大于1 mg 时，含量明显降低，是由于酵母菌数量逐渐增多而达到过饱和状态，从而将黄酮分解利用，降低了其抑制率与含量[8]。故接种量以1 mg 为宜。

图1 接种量对艾灰黄酮含量的影响

2.2 温度对黄酮含量的影响

由图2 看出，当温度小25 ℃时，随着温度的升高，含量也随之增大，当温度大于25 ℃时，含量明显降低，原因是酵母菌在此温度下时的活性最高，但在高于或低于此温度下，酵母菌的生长会受到影响从而导致黄酮含量与其抑制率的降低[9]。故温度以25 ℃为宜。

图2 温度对艾灰黄酮含量的影响

2.3 发酵天数对黄酮含量的影响

据图3 可以看出，在发酵天数小于3 d 时，抑制率和黄酮含量稳步增加，但到第4 天开始出现明显的下降，原因是由于发酵天数太长导致微生物数量出现过饱和状态，黄酮被分解利用，从而降低了黄酮含量。从而使发酵时间对抑制率的影响出现了降低的趋势。因此发酵天数为3 d。

图3 发酵天数对艾灰黄酮含量的影响

2.4 料液比对黄酮含量的影响

据图4 可以看出，当料液比小于1∶15 时，随着料液比的升高，含量也随之增大，当料液比大于1∶15 时，含量明显降低，说明随着溶剂量的逐渐增大，溶剂的浸润作用使得黄酮类化合物溶出量增大，但当溶剂量超过原料15 倍以后过量的溶剂会使其他杂质溶出[9]，故料液比以1∶15 为宜。

图4 料液比对艾灰黄酮质量分数的影响

3 结论

本文通过单因素实验，确定的艾灰黄酮提取液适宜发酵条件为：发酵天数3 d、接种量1.0 mg、温度25 ℃、料液比1∶15，其中的黄酮含量最高可达48.8%。实验证明，发酵对提高提取液中的黄酮含量具有重要作用，经发酵后艾灰中的黄酮含量得到了显著提高，其活性也明显增强，因此，研究其抗氧化等活性将是下一步需要做的工作。