浐灞河生态区冬夏季节微生物群落结构特征研究

刘泽岸 孙 琳

(浙江省水利水电勘测设计院有限公司,浙江 杭州 310002)

近年来,西北地区城市化不断加快,城镇居民集中的地区有大量含氮污水排放到水体中,城市河流的水环境污染日益严峻[1]。河流作为城市形成与发展过程中的资源和环境的重要载体[2],现今在饮用水工程[3]、工业用水[4]、农业灌溉[5]及景观娱乐[6]等方面都起到重要作用。因此,城市河流环境和生态问题的日益突出将在一定程度上影响城市的发展[7-8]。而微生物对外界环境变化较为敏感,微生物的研究已经广泛应用到水体污染治理、污染土壤修复等工程中[9-12]。微生物可以通过同化和异化作用来降解污染物[13],减少污染物的积累,有助于维持水生态系统的稳定。

当前关于城市水体微生物群落的研究仍以湖泊为主[14-16],对于河流微生物的研究相对较少[17-19]。如万甜等[20]采用高通量测序技术对渭河流域微生物群落多样性进行了分析;袁博等[21]研究了灞河流域溶解性有机质(DOM)的荧光光谱特征及其对细菌组成的影响;王佳等[22]通过聚合酶链式反应(PCR)—变形梯度凝胶电泳(DGGE)技术对丰水期、平水期和枯水期的浑河底泥微生物进行了指纹图谱分析。对于城市河流水体中微生物的研究则更少。张崇淼等[23]通过细菌培养技术、PCR检测和DGGE分析技术,对城市河流浐灞河中的异氧菌耐药率、四环素抗性基因进行了研究。本研究基于Illumina MiSeq高通量测序技术获取浐灞河生态区水体中微生物信息,分析城市河流的微生物群落结构的空间分布规律和多样性;通过冗余分析 (RDA)探究微生物群落与环境因子之间的相关关系。这对流域水生态系统健康发展具有重要意义,为西安城市河流的污染治理、微生物生态修复及水环境健康发展提供理论支撑和依据。

1 方 法

1.1 研究区域概况

浐灞河生态区位于浐灞河的城市段,地处西安市城区东部,南起浐河绕城高速,北至灞河入渭口,区域地势为南高北低,由人为修筑橡胶坝、人工护坡等方式,形成城市浅水河流。浐河与灞河作为主要水体,连接秦岭和渭河,是西安市生态敏感的地带,其水生态的变化产生的影响辐射巨大[24]。研究区域内分布两处污水处理厂,其中西安市第三污水处理厂位于浐河桃花潭处,西安市第五污水处理厂位于灞河下游,其出水口均在河道沿岸,出水汇入河流;区域内共分布22座橡胶坝,其中灞河段10座,浐河段12座,通过橡胶坝严格控制浐灞河水位和流量,在营造城市水景观、维护城市水安全等方面起到重要作用。

1.2 采样点布设与样品采集

基于水质监测和河流采样点的布设原则,结合浐灞河生态区的水环境现状,对流域采样点布置如图1所示,以进行水体样本的水质和微生物分析。分别于2019年2月和7月进行冬、夏两季采样,采样点自下游到上游依次是入渭口、第五污水处理厂出水口、浐灞交汇口、世博园、第三污水处理厂出水口、长乐东路。其中,夏季时的长乐东路点因施工原因未采集到。对冬季各采样点依次记为A1、A2、…、A6;对夏季各采样点记为B1、B2、…、B5。

图1 采样点示意图

依据采水原则,在水浅处采水,以不泛起河流底层沉积物为准;在水深处应在水面下50 cm处采水。在采集前先用采样点水体润洗采水容器,在水面下30 cm处取1 000 mL水样,用无菌聚乙烯瓶临时保存在4 ℃以下的保温箱中,直至运送到实验室。

1.3 测定项目

1.3.1 水质指标测定

1.3.2 脱氧核糖核酸(DNA)的提取和高通量测序

取500 mL水样,使用0.45 μm微孔滤膜对水样抽滤,把获得的水体微生物样品储存在-20 ℃环境下。测序具体流程如下:采用DNA提取试剂盒(FastDNA®Spin Kit for Soil)提取DNA时,操作步骤按照试剂盒说明书进行。使用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量,并采用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计对DNA进行定量分析。PCR扩增及其高通量测序采用特异引物为5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’,对16S rRNA基因的V4～V5区进行扩增[25]。PCR扩增采用TransGen AP221CCGTC02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,即全部样本按照正式实验条件进行。将PCR扩增产物混合后经2%琼脂糖凝胶电泳检测后,使用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒进行回收。在PCR扩增产物荧光定量后采用Illumina MiSeq PE250/PE300进行高通量测序。用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库:对获得的扩增产物进行序列末端修复,采用BECKMAN AMPure XP Beads,通过磁珠筛选,去除接头自连片段,纯化添加接头后的文库体系,使用2%琼脂糖凝胶电泳对文库做最终的片段选择与纯化。测序委托上海派森诺基因有限公司进行,对原始序列进行预处理,选取高质量的操作分类单元(OTU)序列进行分析。

1.4 数据分析和处理

采用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行Paired-end (双端)测序,原始双端测序数据经滑动窗口法进行质量筛查,质量合格后使用Flash软件对样品进行reads配对连接。运用Qiime软件识别疑问序列,调用Usearch v5.2.236检查并剔除嵌合体序列。

对优质序列通过QIIME (http://qiime.org/ tutorials/index.html)进行OTU划分,获得每个OTU所对应的分类学信息。通过绘制稀释曲线和计算用于Alpha多样性统计。利用Canoco5.0软件对微生物群落和环境因子开展主成分分析(PCA),分析样本间的相似性与差异性,Origin9.1绘制丰度柱状图。

2 结果与讨论

2.1 水质状况分析

表1为浐灞河生态区各采样点在冬、夏两季的理化指标特征。冬季各采样点WT在8.2～14.3 ℃,其中A2和A5采样点作为污水处理厂出水口WT较高。根据《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002),各采样点TN均低于Ⅴ类水标准。冬季各采样点TP在0.131～0.558 mg/L,均值为0.297 mg/L,总体表现为Ⅳ类水标准,其中A4和A6采样点的TP表现为Ⅲ类水标准,A1采样点TP最高,为0.558 mg/L。夏季各采样点TP为0.080～0.408 mg/L,均值为0.220 mg/L,总体表现为Ⅳ类水标准,在B3和B4采样点的浓度较低,为Ⅱ类水标准,在B2采样点最高,为0.408 mg/L。

冬、夏季浐灞河生态区水体理化指标具有明显的空间差异性。污水处理厂出水口附近各物理化学指标均有异于其余采样点,具体表现为WT大多略高于受纳水体,pH大多略低于其他采样点,DO含量略低于其他采样点。此外,灞河上游水质优于下游,在浐河汇入后,灞河下游水质变差;污水处理厂出水口的TN、TP、COD各污染指标大多升高,是造成浐灞河生态区水体理化指标空间差异性的主要因素。

由表1可以看出,采样点水质指标劣于Ⅴ类水标准,主要是TN严重超标。可见氮污染是导致浐灞河水质较差的主要原因。国内许多研究人员对浐灞河生态区水质状况进行了调研和分析,孙佳乐[26]通过分析得出,两个污水处理厂出水口处WT、营养盐浓度比浐灞河生态区段其他采样点浓度高,且TN低于Ⅴ类水要求;陈红[27]对灞河城市段水质调研结果表明,TN在全年各采样点均处于劣Ⅴ类水,为污染程度最高的指标。通过分析国内研究人员对浐灞河水环境状况的调研成果,结合西安市实际情况,得出水质污染的主要原因有以下几个方面:作为城市河流,部分未达标的工业和未处理的生活污水直接排入河道;地表径流补偿减少,河流自净能力下降;上游工业生产混乱,砍伐无序,破坏地表径流规律,间接污染水质[28]。

表1 各采样点理化指标

可以通过采取以下防治措施改善河流水质:做好河流保护工作,上游河道两侧做好林木防护,河流城市段建设护栏;严控污染排放问题,对于上下游工业和生活污水排放、污水处理厂排水,建立责任明确的规章并严格执行。此外,除了传统水质防治措施外,微生物修复技术也应得到广泛应用。

2.2 微生物群落多样性分析

微生物群落的多样性,目前常用Alpha多样性来描述,可以直观反映不同环境微生物群落丰富度、多样性和均匀度,包括丰富度指数(Chao1指数、ACE指数,反映丰富度)和多样性指数(Shannon-Wiener指数、Simpson指数,反映多样性和均匀度)。微生物Alpha多样性统计结果见表2。

由表2可得,冬季各采样点的Chao1指数和ACE指数最高的是采样点A5,最低的是A1。两个丰富度指数表现出的采样点变化趋势一致,均表现为A5>A2>A3>A6>A4>A1。Shannon-Wiener指数和Simpson指数最高的是采样点A5,最低的是采样点A2。各采样点Shannon-Wiener指数大小顺序依次为A5>A6>A4>A3>A1>A2,Simpson指数大小顺序依次为A5>A6>A4>A1>A3>A2。

分析结果可知,A5采样点作为第三污水处理厂出水口,采样点丰富度、多样性与均匀度在所有采样点中最高;而A2采样点丰富度指数较高,多样性指数却最低,表明物种较多,均匀度却较差,可能的原因是污水处理厂出水导致出水口附近水体富营养化严重,各类营养盐含量较高,为微生物提供了营养物质。

由表2可得,夏季各采样点的Chao1指数和ACE指数最高的是采样点B2,最低的是采样点B4。两个丰富度指数趋势一致,大小顺序依次为B2>B5>B3>B1>B4。Shannon-Wiener指数和Simpson指数最低的均是采样点B4。Shannon-Wiener指数最高的是采样点B2,Simpson指数最高的是采样点B3与B2。Shannon-Wiener指数大小顺序依次为B2>B5>B3>B1>B4,Simpson指数大小顺序依次为B3=B2>B5>B1>B4。

表2 Alpha多样性统计结果

分析结果可知,夏季各采样点微生物群落指数大小趋势大体一致,均显示在B2采样点,即第五污水处理厂出水口最大,意味着该点微生物群落丰富度、多样性与均匀度在所有采样点中最高,第三污水处理厂出水口采样点次之,B4采样点最小。

总体来看,夏季各采样点微生物群落多样性高于冬季,在同一季节微生物群落多样性存在空间差异,污水处理厂出水口微生物群落多样性相对更高，表明浐灞河生态区水体的微生物群落特征有显著的时空差异。

2.3 微生物群落分布规律

冬、夏季各采样点菌群在门水平上总体相似,但又存在差异。在冬季,变形菌门(Proteobacteria)在所有采样点中相对丰度最高,为47.0%,是研究水域的代表菌门;其次是拟杆菌门(Bacteroidetes),其相对丰度为30.3%,在每个采样点中仅次于变形菌门;蓝藻门(Cyanobacteria)在A1、A3采样点相对丰度较高;放线菌门(Actinobacteria)在各采样点中都有分布,在A3、A4采样点相对丰度较高;剩余菌门只分布于个别采样点。放线菌门、蓝藻门相对丰度分别为12.1%、5.2%。各采样点中,A5采样点物种门类最多即多样性最好,A2采样点门类最少,物种均匀度低。

在夏季,变形菌门在所有采样点相对丰度最高,为50.7%;其次是放线菌门,相对丰度为20.9%,除在B1采样点相对丰度略低,在其余采样点中相对丰度仅次于变形菌门;蓝藻门相对丰度在B1采样点相对丰度仅次于变形菌门,在所有采样点中最高,相对丰度呈下游大于上游趋势;厚壁菌门(Firmicutes)主要分布在B4、B5采样点,其他采样点相对丰度很低或无;拟杆菌门在各采样点分布相似但相对丰度较小;其他菌门在不同采样点相对丰度分布差异较大。除了变形菌门外,放线菌门、蓝藻门、厚壁菌门的相对丰度分别为20.9%、14.3%、6.0%。

由图2可总结出，冬、夏两季门水平菌群以变形菌门、蓝藻门、拟杆菌门和放线菌门等优势细菌为主。已有众多学者发现它们广泛分布于淡水水域中[29-30]，存在显著的季节性差异,菌群组成与相对丰度都有明显变化。在冬季与夏季的菌群组成中,变形菌门相对丰度均最大,且大多夏季大于冬季。变形菌门包含的部分菌属有利于水质净化(如氧化氨的亚硝化单胞菌属)。此外,变形菌门也包括很多病原菌(如霍乱弧菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等),在具有净化水质功能的同时也存在致病风险;放线菌门夏季的相对丰度大于冬季,季节之间相对丰度变化幅度明显,它是一类革兰氏阳性细菌,在污水的处理等方面也有广泛的用途;蓝藻门在冬季与夏季均出现在菌群中,相对丰度夏季大于冬季;拟杆菌门相对丰度冬季大于夏季,其在冬季是主要菌群，相对丰度在各采样点均很大,夏季相对丰度大大降低,很多拟杆菌纲的菌种生活在人或者动物的肠道中,有些时候成为病原菌[31-34]。

图2 冬、夏季各采样点门水平微生物群落结构分布

2.4 微生物群落相似性分析

通过R软件,对属水平的微生物群落结构进行PCA分析。冬、夏季微生物群落PCA分析结果见图3。

图3 冬、夏季菌群PCA分析

由图3 (a)可知,PCA第一主成分(PC1)对各样本物种差异解释率为57.76%,第二主成分(PC2)对各物种差异解释率迅速下降为27.33%,共占85.09%,说明能够充分表达微生物群落实际的差异性和相似性。此外,A2游离于各采样点之外,可能是第五污水处理厂的出水影响该点微生物群落结构,导致该点并不与相邻采样点聚集。

由图3 (b)可知,PC1对各样本物种差异解释率为62.16%,PC2对各物种差异解释率迅速下降为17.84%,共占80.00%,说明能够充分表达微生物群落实际的差异与相似性。B4独自游离于其他采样点之外,表明在夏季,浐灞河生态区段上游与下游菌群结构差异明显。

2.5 微生物群落与环境因子相关性分析

本研究基于Canoco5.0软件,选取相对丰度较高的细菌门分类水平进行微生物群落与环境因子之间的相关性分析,7个环境因子共解释了80.10%的物种变化信息，如图4所示。从环境因子的向量长度可以看出:大部分环境因子对物种的分布影响较大,其中WT最大，为35.20%,pH、DO次之，分别为15.80%、9.30%。将物种向量与环境因子向量结合分析:蓝藻门与WT、pH、DO呈正相关,与TP、TN、氨氮、COD呈负相关;浮霉菌门与WT、COD呈正相关,与TP、TN、氨氮、pH、DO呈负相关;变形菌门、放线菌门、厚壁菌门与WT、COD呈正相关,与TP、TN、氨氮、pH、DO呈负相关;绿弯菌门与WT、COD、TP、TN、氨氮呈正相关,与pH、DO呈负相关;拟杆菌门、疣微菌门与TP、TN、氨氮、pH、DO呈正相关,与WT、COD呈负相关。7个环境因子只有WT(P=0.004)、pH(P=0.019)和DO(P=0.042)达到了显著性水平,而其他环境因子未达到显著性水平,表明水体的WT、pH以及DO是影响冬、夏两季生态区段水体微生物群落结构变化的关键环境因子,它们的影响比TN、TP等化学指标更显著。

图4 物种—环境因子RDA

3 结 论

(1) 浐灞河生态区水质污染因子主要为TN,灞河上游水质优于下游,在浐河汇入后,灞河下游水质变得更差,污水处理厂出水口处水质最差。

(2) 利用Illumina MiSeq高通量测序技术,对浐灞河生态区6个采样点冬、夏季节水样进行测序,得出冬季两个丰富度指数均表现为A5>A2>A3>A6>A4>A1,两个多样性指数均为A5最高、A2最低;夏季各采样点微生物群落指数大小趋势大体一致。夏季各采样点微生物群落多样性总体高于冬季,在同一季节微生物群落多样性存在空间差异,污水处理厂出水口微生物群落多样性相对更高。浐灞河生态区水体的微生物群落呈现显著的时空差异特征。

(3) 在夏季,变形菌门的相对丰度最高,为50.7%,其次为放线菌门,相对丰度为20.9%;在冬季,变形菌门的相对丰度最高,为47.0%,其次为拟杆菌门,相对丰度为30.3%。

(4) 微生物群落与环境因子之间的相关性分析结果显示,7个环境因子只有WT(P=0.004)、pH(P=0.019)和DO(P=0.042)达到了显著性水平,表明WT、pH以及DO是影响冬、夏两季生态区段水体微生物群落结构变化的关键环境因子,这些相关性关系解释了浐灞河水质分布规律。