番茄根结内生真菌诱导植株对南方根结线虫的抗性研究

姚玉荣，霍建飞，贲海燕，郝永娟，王万立

（天津市农业科学院 植物保护研究所，天津 300384）

番茄（Mill.）是我国重要的蔬菜作物之一，据统计，2018年全国番茄栽培面积135万hm，在蔬菜产业中具有重要地位。近年来保护地蔬菜栽培面积持续增加，而番茄种植收益较高，因此保护地番茄种植已经成为农民脱贫致富的重要途径。根结线虫是一类重要的植物寄生线虫，寄主植物高达3 000多种，严重威胁世界各地蔬菜、经济作物及农作物等安全生产。随着保护地蔬菜种植年限的增加，特别是越冬温室蔬菜面积的扩大，为根结线虫幼虫和卵的越冬提供了更有利的环境，导致根结线虫病害的发生情况逐年加重，蔬菜减产20%~30%，严重时达60%~70%，严重影响了设施蔬菜的产量、效益及农业的可持续发展。目前，化学防治仍然是治理根结线虫病害重要措施之一，应用最多的是土壤熏蒸剂和触杀性杀线剂。由于根结线虫抗药性的增加，仅仅依靠单一的杀线虫剂已经很难控制根结线虫的危害，因此寻找一种高效防治根结线虫病害且对环境友好的技术显得尤为重要。

研究表明，植物内生菌能够定殖于植物内部，定殖后不仅能够促进植物的生长，而且能诱导植物防御反应提高植株对逆境胁迫的抗性。

虽然利用植物内生真菌防治线虫植物寄生线虫的研究较少，但是内生真菌在防治线虫方面发挥重要的作用。Hallmann和Sikora发现，番茄内生真菌代谢产生的次级代谢产物对二龄幼虫有致死作用。Bajaj等发现，印度梨形孢能够减少大豆胞囊线虫卵的数量。

本研究对天津市主要番茄种植区番茄根结线虫病样进行采集，采用组织分离方法获得其根结中的内生真菌，利用真菌的分子生物学鉴定方法解析了番茄根结内生真菌的群落多样性；通过触杀法测定内生真菌发酵液对根结线虫的生物活性，研究内生真菌诱导番茄对根结线虫的抗性。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究于2017—2020年在天津市各区进行番茄根结线虫病样采集以及发生情况调查，并采集根结线虫病样。采样地点见表1。

表1 根结线虫病样采样地点

1.2 内生真菌的分离纯化

内生真菌的分离参照Dababat方法，略有改进。将新鲜的番茄根冲洗干净，剪下根结用0.5%次氯酸钠处理后，用无菌水漂洗3次，然后切成小段，将其挑到混有100 mg·L氨苄青霉素和150 mg·L硫酸链霉素的PDA平板上，用于检测表面消毒情况，放置2 min后再挑到新的PDA平板上，每个平板放置5~6段。将培养基置于25℃的培养箱中培养，每隔2 d检查片段上长出的菌落。不能在检测表面消毒情况的平板上长出，但是能从另一平皿的根结片段上长出的菌株视为内生真菌。对于长出的真菌用单孢分离方法进行纯化，保存备用。

1.3 内生真菌分子生物学鉴定

将提取纯化的DNA，用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4进行扩增。PCR扩增体系为：2×Flash PCRMaster Mix 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，DNA模板2 μL，加ddHO将扩增体系补足至50 μL。扩增程序为：98℃，30 s；94℃，10 s；58℃，15 s；72℃，10 s；35个循环；72℃，1 min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送安升达（天津）生物科技有限公司测序。测序结果在NCBI网站进行BLAST同源性分析，确定菌株分类地位。

1.4 内生真菌杀线虫生物活性测定

内生真菌发酵滤液准备：在含有PDB的三角瓶中接入将活化的菌片（d=5 mm），置于温度为28℃，转速为120 r·min的摇床上培养5 d。培养的菌液于5 000 r·min离心15 min，获得发酵上清液。供试线虫（南方根结线虫）由天津市农业科学院植物保护研究所蔬菜病害室分离鉴定，在番茄上扩繁。待番茄上的线虫成熟后，用自来水冲洗番茄根部，挑取新鲜的线虫卵块，置于0.1%次氯酸钠进行表面消毒，无菌水冲洗3次后，于28℃恒温培养箱中进行孵化，将孵化的南方根结线虫J2浓度调至1 000条·mL备用。

1.5 内生真菌诱导番茄对根结线虫入侵抗性的测定

供试菌株：将1.4中筛选出的具有杀线虫活性的菌株转接到PDA平板中，于28℃恒温培养箱中培养活化。活化后的菌株接种于200 mL PDB溶液中，置于温度为28℃，转速为150 r·min的摇床上恒温培养3 d后，用灭菌过滤网过滤，收集孢子并将浓度其调至1×10cfu·mL。

幼苗准备：番茄种子55℃温汤浸种30 min，然后用30℃左右温水浸泡4~6 h，28℃培养箱中催芽48 h后，播于50孔育苗穴中，温室育苗。待番茄苗龄至4~6片叶时取出洗净，将根系分为均等的两部分进行分根移苗。

内生真菌诱导番茄对根结线虫抗性测定采用裂根法试验，参照鄢小宁等方法，略有改进。番茄分苗后7 d后，在分根一侧接种菌株孢子液即挑战根系，接种14 d后，在分根另一侧（未接菌）接种南方根结线虫1 000条·株称为应答根系。番茄苗接种南方根结线虫3周后，检测线虫入侵数量，参照刘维志方法配制酸性品红溶液。将接种南方根结线虫的根系取出，清洗干净后，浸入酸性品红溶液中，微波炉加热3 min，染色后的根系置于4℃冷藏过夜后自来水清洗，剪碎，加入清水，用组织匀浆机破碎3次，每次20 s，将线虫从根系组织中释放出来，统计入侵线虫数量，每个处理15株，3次重复。试验数据用IBM SPSS Statistics 21.0软件处理，用DMRT进行多重比较。菌株处理后线虫入侵率显著降低的菌株，计算接种南方根结线虫根系即应答根系中线虫入侵的降低率。

入侵降低率=[（对照应答根系中入侵线虫数量-菌株处理应答根系中入侵线虫数量）/对照应答根系中的入侵线虫数量]×100%

2 结果与分析

2.1 根结线虫发生情况

笔者对天津市各区进行番茄根结线虫病样采集以及发生情况调查。调查结果发现，天津市武清区、宝坻区、西青区、蓟州区、北辰区等主要蔬菜产区的根结线虫病发生较为普遍，且呈现一种快速上升的发展态势，对当地设施蔬菜生产造成了极大的危害，严重影响了设施蔬菜的产量、效益和可持续发展，发病严重的地区根结线虫造成蔬菜产量损失高达80%以上,甚至绝产。

2.2 内生真菌多样性分析分子生物学鉴定

结果显示，从番茄根结中共计分离到81种内生真菌（表2），其中分离频率最高的真菌是镰刀菌属真菌，共计47株，占总数量的58%（图1）。除镰刀菌属外还包括淡紫拟青霉、枝孢霉、毛壳菌、青霉菌等。由此可见，尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌是番茄根结中主要的内生真菌，这些真菌被根结线虫携带进根结内，与根结线虫形成病害复合体，造成根结腐烂。

表2 番茄根结内生真菌ITS鉴定分析

图1 番茄根结内生真菌分离频率

2.3 内生真菌杀线虫活性生物分析

从分离得到的内生真菌中筛选到4株杀线虫活性较好的内生真菌分别为枝顶孢霉、、毛壳菌sp.，拟青霉sp.，处理48 h杀线虫活性分别为91.5%，95.0%，72.8%，86.4%（表3）；内生尖孢镰刀菌杀线虫活性较低为21.8%，其余菌株对南方根结线虫J2无毒杀活性。

表3 内生真菌发酵液对南方根结线虫J2生物活性测定

2.4 内生真菌诱导番茄对根结线虫抗性测定

由表4可知，内生真菌、、sp.及sp.在挑战根结接种后，应答根系中根结线虫的入侵率显著降低。4株内生真菌中枝孢霉诱导番茄产生对根结线虫入侵的抗性最强，入侵率降低48.96%；其次为，入侵率降低34.48%；sp.和sp.入侵率较低，分别为17.17%，25.10%。

表4 内生真菌诱导番茄对根结线虫抗性

3 结论与讨论

内生真菌对根结线虫的作用方式主要包括2种：直接作用（产生杀线虫活性的次级代谢产物）、间接作用（改变寄主植物的生理生化反应）。Strom等从玉米和大豆根系中分离得到626株内生真菌，属真菌是玉米和大豆中最常见的具有杀线虫活性的内生真菌，大豆根系中内生真菌群落多样性与胞囊线虫的种群密度成正相关。沈清清等从鬼针草内分离的内生真菌GF1，发酵液原液作用12 h对线虫的校正死亡率达到94%以上。Daneshkhah等研究发现，内生真菌印度梨形孢（）在拟南芥根部定殖后，能够提高自身抗性，显著降低线虫生命力、感染性和繁殖力。研究发现，内生真菌的作用不是单一的，本研究结果也支持这一结论。

本研究发现，枝顶孢霉、、毛壳菌sp.，拟青霉sp.对根结线虫二龄幼虫具有较强的致死活性，处理48 h后，死亡率70%以上；内生真菌枝孢霉诱导番茄产生对根结线虫入侵的抗性最强，入侵率降低48.96%；其次为，入侵率降低34.48%；sp.和sp.入侵率较低，分别为17.17%和25.10%。Vu等发现，内生镰刀菌接种后，香蕉穿孔线虫（）在应答根系的入侵率降低30.0%~38.5%；Dababat等研究发现，内生镰刀菌Fo162菌株接种后诱导其抗性，答根系的根结减少21%~36%，研究结果均与本研究结果一致。

内生真菌诱导植株抗性与定殖时间紧密相关，Fuchs等发现，内生镰刀菌Fo47在接种初期诱导番茄对枯萎病的抗性，但是随着时间的增加，菌株在植物体内定殖后，抗性逐渐消失。因此，内生真菌诱导寄主植物对根结线虫的抗性的持续时间有待进一步研究。