有机酸Fe2+与无机酸Fe2+驯化的保加利亚乳杆菌发酵特性的比较分析

马章献

（润盈生物工程（上海）有限公司，上海 200000）

缺铁是当前世界上主要的营养问题之一，主要影响育龄妇女、婴儿与儿童[1-2]。这通常由膳食铁摄入不足、摄入食物中铁的利用率低，或两者兼而有之引起[3]。增加铁的摄入量是缺铁人群最主要的改善营养状况的方式[4-8]。乳制品是钙和磷的主要膳食来源[9]，但它们的铁含量极低[10-11]。富含铁的乳品将有助于满足通常食用更多乳制品的缺铁高危人群的营养需求。目前已有关于制造富含铁的乳制品的报道[12-14]，其中对铁强化酸奶的研究较为丰富[15-16]。例如益生菌联合富马酸亚铁能够显著提高缺铁性贫血患者的治疗效果，改善患者贫血症状，其中有机铁比无机铁对肠胃刺激性小且易于吸收[17-18]。

酸奶在乳制品市场中占据了较大的比重，搅拌型酸奶作为其中的一种类型，口味多样、营养丰富，越来越受到大家的欢迎[19-20]。酸奶发酵剂是为制作酸奶和乳酸菌饮料而调制的特定微生物的培养物[21]，保加利亚乳杆菌是酸奶生产中常用的发酵剂[22]。

正确选择合适的铁源对于生产富含铁的酸奶非常重要，本研究分析了不同含Fe2+盐发酵培养基培养出的保加利亚乳杆菌在接种酸奶发酵过程中酸度、黏度等发酵活力参数，为酸奶的铁强化以及发酵剂优化选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与试剂

保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus）LB117，由润盈生物工程（上海）有限公司研发中心实验室乳酸菌菌种资源库提供。

一水葡萄糖，食品级，阜丰集团有限公司；硫酸镁、硫酸锰与磷酸氢二钾，食品级，江苏紫东食品有限公司；柠檬酸氢二铵，食品级，南通市飞宇食品科技有限公司；富马酸亚铁、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁与柠檬酸铁铵，食品级，连云港龙泰威食品配料有限公司；牛肉浸粉，食品级，山东玉宝生物科技股份有限公司；蛋白胨，食品级，荣氏生物制品（苏州）有限公司；酵母膏，食品级，山东圣琪生物有限公司。

1.1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；BioFlo/CelliGen 115玻璃通气发酵罐、5417R台式冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司；PowerPac Basic电泳仪、Gel Doc XR+凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司；DV-C 数显黏度计（S63转子），美国Brookfield公司。

1.1.3 培养基配方

MRS培养基：葡萄糖20 g，牛肉浸粉10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，无水乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，吐温-80 1 g，硫酸镁0.25 g，硫酸锰0.05 g，用水定容至1 L。

保加利亚乳杆菌培养基：葡萄糖20 g，牛肉浸粉2 g，蛋白胨15 g，酵母膏6 g，无水乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，吐温-80 1g，硫酸镁0.25 g，硫酸锰0.05 g，Fe2+盐（富马酸亚铁/硫酸亚铁/柠檬酸亚铁/柠檬酸铁铵）0.25 g，用水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

取保加利亚乳杆菌（LB117）脱脂乳冻干管，接入121 ℃灭菌15 min后冷却至室温备用的200 mL液体MRS培养基中，三角瓶规格为500 mL。37 ℃培养15 h，每代接种量为2%，传3代种子液备用。

1.2.2 驯化传代培养

分别配制含富马酸亚铁、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁铵的保加利亚乳杆菌培养基各4 L，编号为1、2、3、4，121 ℃灭菌15 min后冷却至37 ℃，接种1.2.1备用种子液，接种量为2%，（37±1）℃培养10～15 h，培养期间控制pH在5.0左右，直到OD值≥8，传15代种子液备用。

1.2.3 种子液制备

分别配制含富马酸亚铁、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁铵的保加利亚乳杆菌培养基各4 L和1组不含Fe2+盐的保加利亚乳杆菌培养基4 L，分别编号1、2、3、4、5，121 ℃灭菌15 min后冷却至37 ℃，1～4号接种1.2.2对应编号的备用种子液，5号接种1.2.1备用种子液，接种量为2%，（37±1）℃培养10～15 h，培养期间控制pH为5.0左右，直到OD值≥8，发酵液迅速降温至10 ℃以下备用。

1.2.4 酸奶制作与指标检测

取纯牛奶（1 L/盒），编号 1、2、3、4、5，在无菌环境中接种对应培养基编号的1.2.3备用种子液，接种量6%，于42 ℃下恒温培养。分别于接种时、接种后每2 h取样测定酸度与pH，酸度＞60°T后每0.5 h取样一次，当测得发酵乳pH≤4.6且酸度＞70°T后终止发酵，发酵结束后测定酸奶黏度并进行菌数计数。

（1）菌数计数

取1.0 mL发酵液加到装有9.0 mL生理盐水的试管中混匀，形成10-1浓度的菌悬液。然后从10-1浓度的菌悬液中取1.0 mL菌悬液到另外一个装有9.0 mL生理盐水的试管中混匀，形成10-2浓度的菌悬液，重复此操作直至得到10-6与10-7浓度的菌悬液。取适宜梯度的菌悬液500 μL到不同的空平板中，再倒入适量的MRS琼脂培养基，摇晃均匀后做好标记置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养2 d左右，待单菌落形成后计数[23]。

（2）酸度测定

采用滴定法测定酸度。称取10 mL酸奶，用浓度为0.1 mol/L的NaOH滴定，换算出酸奶的吉尔涅尔度。

（3）黏度测定

转速30 r/min，搅拌30 s后用黏度计测量读数。

（4）感官评定

以20人的评价小组对酸奶进行评分检验。评价内容为拉丝性、气味、滋味、细腻度、稠厚感、爽滑度、好感度，每个指标满分均为20分。

1.2.5 数据分析

用SPSS 23.0进行数据分析，Duncan氏新复极差法（SSR法）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 保加利亚乳杆菌种子液活菌数测定

以保加利亚乳杆菌种子液活菌数为考察对象，可以发现有机酸Fe2+驯化传代培养的保加利亚乳杆菌富马酸亚铁组最高，无机酸Fe2+驯化传代培养的保加利亚乳杆菌活菌数与对照组相近，且均较低（见表1）。

表1 保加利亚乳杆菌发酵液活菌数

通过计数发现，无机酸Fe2+对活菌数没有显著影响，有机酸Fe2+驯化后活菌数显著增加，且富马酸亚铁组增长效果最好，表明有机酸Fe2+驯化是保加利亚乳杆菌增殖因子，可促进保加利亚乳杆菌的增长[18]。

2.2 对酸奶黏度的影响

黏度是反映酸奶质量的重要指标，它是乳成分在发酵及贮运过程中发生变化的直接体现，影响酸奶的感官质量。在发酵过程中，保加利亚乳杆菌将乳糖和葡萄糖、果糖转变为乳酸，使牛奶pH由6.5降低至4.6以下，使酪蛋白和乳清蛋白聚集凝固并包裹住水和脂肪。体系中颗粒的大小是影响黏度的一个重要因素，酪蛋白凝固使体系内颗粒直径急剧增加，其形成的胶状结构限制了水的自由活动，且酪蛋白的沉淀及保加利亚乳杆菌产生的胞外多糖等均可导致发酵乳的黏度增加。

添加不同Fe2+盐培养后的保加利亚乳杆菌对发酵乳的黏度影响见图1。由图1可知，发酵乳的黏度排序为1号组＞3号组＞4号组＞5号空白对照组，2号组与5号空白对照组非常接近。有机铁Fe2+驯化传代培养的保加利亚乳杆菌发酵酸奶黏度高于空白对照组，而无机酸Fe2+驯化传代培养的保加利亚乳杆菌发酵酸奶黏度与空白对照组非常接近，说明有机Fe2+（富马酸亚铁、柠檬酸亚铁与柠檬酸铁铵）驯化传代培养的保加利亚乳杆菌发酵酸奶在酸奶感官质量方面有一定优势，推测在驯化过程中菌株胞外多糖生产能力有所提高，改变菌种发酵黏度极低的特点，增强了酸奶质构。

图1 不同保加利亚乳杆菌发酵乳的黏度

2.3 对发酵时间的影响

产酸快慢决定着发酵周期的长短，产酸能力反映菌株的发酵活力[24]。发酵时间是评价发酵菌活力的重要指标，发酵时间越短越有利于企业节省成本、提高效率。添加不同Fe2+盐培养后的保加利亚乳杆菌对发酵时间的影响见图2。对比发现对照组发酵速度最慢，说明用有机酸Fe2+与无机酸Fe2+驯化培养的保加利亚乳杆菌都可有效增加发酵活力，缩短酸奶发酵时间，其中富马酸亚铁的效果最明显（P＜0.05）。

图2 不同保加利亚乳杆菌发酵乳的发酵时间

2.4 对酸奶活菌数的影响

益生菌发挥相应的功效必须以活菌数为先决条件[25]。酸奶在发酵完成后于4 ℃冷藏，在这样的低温下，乳酸菌等益生菌处于休眠或半休眠状态，所以活菌酸奶只要严格低温保存，在保质期内其口感可基本保持一致。添加不同Fe2+盐培养后的保加利亚乳杆菌对酸奶发酵终点（pH4.5）时活菌数的影响见图3，1号组、3号组与4号组活菌数显著高于5号空白对照组和2号组，即有机酸Fe2+驯化传代培养的保加利亚乳杆菌比无机酸Fe2+驯化传代培养的保加利亚乳杆菌在功效发挥方面有一定优势。

图3 不同保加利亚乳杆菌发酵乳的活菌数

2.5 发酵过程中酸度变化对比

乳酸可促进乳蛋白的吸收，抑制肠内病原性微生物的生长，酸奶中由乳酸产生的酸度能增进产品的风味，增加人的食欲[26]。添加不同Fe2+盐培养后的保加利亚乳杆菌对酸度的影响见图4，产酸速度排序为1号组＞3号组＞2号组＞4号组＞5号组（空白对照），说明用有机酸Fe2+与无机酸Fe2+驯化培养的保加利亚乳杆菌都可高效产生乳酸，发酵速度快。

图4 不同保加利亚乳杆菌发酵乳的发酵期间酸度变化

2.6 发酵过程中pH变化对比

发酵酸奶中的pH随着乳酸的产生不断下降，反映出保加利亚乳杆菌在发酵乳中的活跃程度，添加不同Fe2+盐培养后的保加利亚乳杆菌对酸奶发酵pH的影响见图5，1号组pH下降最迅速，4号组与5号组（空白对照）比较接近，其趋势与酸度产生的速度基本符合；当pH降低至4.5左右时，所有菌种都会受到发酵产物的抑制，pH不再变化。

图5 不同保加利亚乳杆菌发酵乳的发酵期间pH变化

2.7 酸奶感官评定结果

感官评定结果见图6，在拉丝性、滋气味、稠厚感、好感度等方面，1号组评价最好，2号组与5号组在爽滑度和细腻度方面评价较好，与上述各指标评价结果相互印证。总体来看，使用富马酸亚铁培养驯化后的保加利亚乳杆菌发酵酸奶，有利于改善感官品质。

图6 不同保加利亚乳杆菌发酵乳的感官评定

3 结论

铁在生物生理过程（特别是线粒体呼吸作用、调节细胞因子的形成以及核酸的合成方面）起着关键作用，因此许多微生物的增殖等生命活动取决于铁的活性[27-29]。本文对有机酸Fe2+（富马酸亚铁、柠檬酸亚铁与柠檬酸铁铵）与无机酸Fe2+（硫酸亚铁）分别驯化传代培养的保加利亚乳杆菌发酵活力进行了对比。结果表明，用有机酸Fe2+与无机酸Fe2+驯化培养的保加利亚乳杆菌都可有效增加发酵活力，缩短酸奶发酵时间，其中接种6%富马酸亚铁驯化传代的保加利亚乳杆菌种子液时，酸奶发酵时间最短，产酸和产黏能力最强，酸奶活菌数最高，发酵活力最强。增进酸奶风味方面无机酸Fe2+驯化培养的保加利亚乳杆菌要逊色一些，而经过有机酸Fe2+（富马酸亚铁）驯化的菌株发酵活力增强后，对风味的贡献也明显增强，为酸奶的铁强化以及发酵剂优化选择提供参考。