菟丝子总黄酮对先兆流产大鼠妊娠结局及Th1/Th2 平衡的作用机制研究

张 堃，吕向坤，焦艾丽，丁雪蕾

（1. 中国人民解放军陆军第八十二集团军医院 妇儿科，河北 保定 071000；2. 石家庄市第四医院 妇科，河北 石家庄 050035）

先兆流产被定义为阴道出血，子宫颈闭合，胎儿宫内存活[1]，是妊娠早期最常见的并发症。其公认危险因素包括高龄（产妇年龄超过35 岁）、既往流产、肥胖和吸烟，此外，子宫畸形、宫颈机能不全、多囊卵巢、糖尿病控制不佳、母体感染、免疫功能障碍以及环境毒素暴露也均可诱导先兆流产发生[2]。经验性建议孕妇卧床休息及使用孕激素为先兆流产常用治疗手段，但没有足够证据证明卧床休息可以预防流产[3]，使用孕激素治疗先兆流产也一直存在争议[4]。临床实践中，当确定特定原因时，应采用定向治疗来预防流产，但先兆流产病因复杂且难以确认，研究发现，炎症参与整个妊娠演变过程，炎症相关参数与妊娠并发症密切相关[5]。Th1 和Th2 细胞是Th 细胞的主要亚群，具有不同的细胞因子产生模式，正常的母体妊娠与Th2 型细胞因子偏倚为主，Th1/Th2 失衡易导致流产发生[6]。菟丝子为旋花科药用植物，其有效成分为菟丝子总黄酮（TFCC），具有止泻、滋补肝肾、益精壮阳和安胎等多种药理功效[7]，但目前关于TFCC 是否可通过调节Th1/Th2 细胞因子失衡进而影响先兆流产大鼠妊娠结局的报道较少。故本实验拟通过药物预处理探讨TFCC 对米非司酮诱导的先兆流产大鼠妊娠结局的影响及作用机制，以期为先兆流产治疗策略制定提供一定的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 7 周龄SPF 级SD 大鼠雌性50只，雄性25 只，体质量为（180 ± 20）g，购自河南省实验动物中心，许可证号为SCXK（豫）2017-0001。恒温（22 ～ 24℃）、恒湿（50% ～ 60%）环境条件下普通饲养，12 h 光-暗交替，适应1 周。本实验经所在单位伦理委员会审批，批号：LJDBSEJTJYY 202005220056。

1.1.2 药品、主要试剂和仪器 TFCC （纯度≥98%）购自南京普怡生物科技有限公司；黄体酮胶囊（50 mg，国药准字H20041902）购自浙江仙琚制药股份有限公司；IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10 ELISA 试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司；兔抗IFN-γ 单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；IL-4 多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；雌二醇、黄体酮ELISA 试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司；RT-qPCR 仪（美 国Bio Rad 公 司）；Varioskan Flash 型多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；FluorChem E 型化学发光凝胶成像系统（美国ProteinSimple 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组、给药及造模 适应性饲养期间，雌鼠每日进行阴道涂片以确定发情周期，将处于动情期雌鼠按2 ∶1 与雄鼠合笼，期间进行阴道涂片，镜下见有大量镰刀形精子，记为妊娠1 d，未怀孕大鼠则于下个动情期继续合笼交配，均成功妊娠。随机将孕鼠分为对照组、模型组、TFCC 低剂量组、TFCC 高剂量组及黄体酮组，每组各10 只，其中，TFCC 低剂量组、TFCC 高剂量组及黄体酮组孕鼠于妊娠1 d 分别灌胃给药3 mg/（kg·d）TFCC、6 mg/（kg·d）TFCC、6 mg/（kg·d）黄体酮，对照组及模型组大鼠灌胃等量生理盐水，连续给药10 d。妊娠11 d 时，模型组、TFCC 低剂量组、TFCC 高剂量组及黄体酮组大鼠均灌胃米非司酮（4 mg/kg）以诱导先兆流产，对照组仅灌胃等量生理盐水。

1.2.2 样品采集与处理 1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉各组大鼠，腹主动脉取血，静置凝固后取血清，3 000 r/min，4℃离心10 min 后取上清液用于ELISA检测；脱颈处死孕鼠，摘取子宫组织并解剖，记录活胚数、死胚数并计算流产率，流产率（%）=死胚数/（活胚数+死胚数）×100%；生理盐水洗涤子宫组织后分别保存于4%多聚甲醛及液氮以用于组织学染色、RT-qPCR 及Western blot 检测。

1.2.3 HE 染色 子宫组织经4%多聚甲醛固定过夜，常规石蜡包埋并制备为4 μm 切片，二甲苯脱蜡、乙醇水化，苏木素染核后盐酸酒精分化，氨水返蓝，伊红染色30 s，脱水、透明，中性树胶封片后，于光学显微镜下观察并采集图片。

1.2.4 ELISA 法检测孕鼠血清相关水平 取离心所得的血清上清液，严格按照试剂盒说明书操作步骤测定雌二醇、黄体酮、IFN-γ、IL-4、TNF-α及IL-10水平。

1.2.5 RT-qPCR 法检测孕鼠子宫组织GATA-3、IL-4、T-bet、IFN-γ mRNA 相对表达水平 提取孕鼠子宫组织总RNA，将纯度及完整性良好的RNA逆转录为cDNA，并以其为模板进行PCR 扩增。Primer Premier 5.0 软件设计引物，引物序列见表1；PCR 扩增条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s 共40 个循环，72℃10 min充分延伸。制备RT-PCR反应体系，2 000 r/min，离心5 min，于实时荧光定量PCR 仪内进行检测定量。以GAPDH 作为内参，以对照组大鼠作为对照，2-ΔΔCt法计算最终目的基因的相对表达量。

表1 GATA-3、IL-4、T-bet、IFN-γ 及内参引物序列Tab. 1 GATA-3, IL-4, T-bet, IFN-γ and their reference primers

1.2.6 Western blot 技术检测孕鼠子宫组织IL-4、IFN-γ 蛋白相对表达情况 取液氮中子宫组织，碾碎后移入预冷裂解液中裂解，12 500 r/min，4°C 离心15 min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度后加热变性。利用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白（压缩胶60 V，22 min；分离胶120 V，70 min），后将蛋白湿转至PVDF 膜上（恒压90 V，4℃，90 min），5%脱脂奶粉封闭40 min 后，于一抗（均1 ∶1 000 稀释）内4℃孵育过夜，1 × TBST 洗涤3 次，15 min/次；后于HRP 偶联二抗（1 ∶10 000 稀释）内室温孵育2 h，1 × TBST 洗涤3 次，15 min/次；后于ECL 显影试剂中反应1 ～ 2 min，化学发光凝胶成像系统曝光并记录，Image J 软件分析条带灰度值，以IL-4、IFN-γ与内参GAPDH 灰度值比值表示蛋白的相对表达量。

1.2.7 统计学方法 用SPSS 26.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 孕鼠活胚数、死胚数及流产率

与对照组比较，模型组孕鼠活胚数减少，死胚数及流产率升高（P< 0.05）；与模型组比较，各给药组孕鼠活胚数增加，死胚数及流产率降低（P< 0.05）；与黄体酮组比较，TFCC 低、高剂量组孕鼠活胚数减少，死胚数及流产率增加（P< 0.05）；与TFCC 低剂量组比较，TFCC 高剂量组孕鼠活胚数增加，死胚数及流产率降低（P< 0.05），见表2。

表2 孕鼠活胚数、死胚数及流产率比较（±s，n = 10）Tab. 2 Comparison of live embryos, dead embryos and abortion rate in pregnant rats （±s，n = 10）

表2 孕鼠活胚数、死胚数及流产率比较（±s，n = 10）Tab. 2 Comparison of live embryos, dead embryos and abortion rate in pregnant rats （±s，n = 10）

注：模型组与对照组比较，*P < 0.05；各给药组与模型组比较，#P < 0.05；TFCC 组与黄酮组比较，&P < 0.05；TFCC 高剂量组与TFCC 低剂量组比较，※P < 0.05，下表同。

组别 活胚数/只 死胚数/只 流产率/%对照组 9.10 ± 0.70 0.70 ± 0.64 6.89 ± 5.92模型组 2.40 ± 0.80* 7.10 ± 0.94* 65.95 ± 8.66*黄体酮组 7.80 ± 0.98# 1.70 ± 0.64# 18.03 ± 6.01#TFCC 低剂量组 4.30 ± 1.10#& 5.90 ± 1.04#& 52.54 ± 11.25#&TFCC 高剂量组 6.50 ± 1.02#&※ 3.70 ± 1.19#&※ 35.93 ± 10.38#&※F 83.360 87.275 76.905 P 0.000 0.000 0.000

2.2 各组孕鼠子宫形态变化

HE 染色结果显示，对照组孕鼠子宫蜕膜细胞染色均匀，细胞排列紧密、规则。与对照组比较，模型组孕鼠子宫内膜结构不完整，细胞排列疏松，间质致密，见有炎性浸润；与模型组比较，TFCC 低、高剂量组及黄体酮组孕鼠子宫组织结构损伤情况逐渐改善，见图1。

2.3 各组孕鼠血清雌二醇、黄体酮、IL-4、IFN-γ、TNF-α 及IL-10 水平

与对照组比较，模型组孕鼠血清雌二醇、黄体酮、IL-4 及IL-10 水平降低，IFN-γ、TNF-α 水平升高（P< 0.05）；与模型组比较，各给药组孕鼠血清雌二醇、黄体酮、IL-4 及IL-10 水平升高，IFN-γ、TNF-α 水平降低（P< 0.05）；与黄体酮组比较，TFCC 低、高剂量组孕鼠血清雌二醇、黄体酮、IL-4及IL-10 水平降低，IFN-γ、TNF-α 水平升高（P<0.05）；与TFCC 低剂量组比较，TFCC 高剂量组孕鼠血清雌二醇、黄体酮、IL-4 及IL-10 水平升高，IFN-γ、TNF-α 水平降低（P< 0.05），见表3。

表3 孕鼠血清雌二醇、黄体酮、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10 水平比较（±s，n = 10）Tab. 3 Comparison of serum levels of estradiol, progesterone, IL-4, IFN-γ, TNF-α and IL-10 in pregnant rats（±s，n = 10）

表3 孕鼠血清雌二醇、黄体酮、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10 水平比较（±s，n = 10）Tab. 3 Comparison of serum levels of estradiol, progesterone, IL-4, IFN-γ, TNF-α and IL-10 in pregnant rats（±s，n = 10）

组别 雌二醇/（pg/mL） 黄体酮/（ng/mL） IL-4/（pg/mL） IFN-γ/（pg/mL） TNF-α/（pg/mL） IL-10/（pg/mL）对照组 287.64 ± 29.60 19.71 ± 2.84 361.62 ± 28.00 57.69 ± 5.72 34.53 ± 4.16 77.59 ± 5.33模型组 198.46 ± 20.91* 10.34 ± 1.53* 248.96 ± 28.40* 88.59 ± 7.01* 59.84 ± 4.79* 48.14 ± 4.37*黄体酮组 269.35 ± 22.94# 16.89 ± 1.37# 336.65 ± 22.31# 64.37 ± 7.21# 39.99 ± 2.56# 70.55 ± 6.22#TFCC 低剂量组 218.65 ± 18.62#& 12.03 ± 1.57#& 278.63 ± 27.77#& 80.89 ± 7.13#& 52.30 ± 3.33#& 52.60 ± 4.29#&TFCC 高剂量组 241.45 ± 20.45#&※ 14.55 ± 1.51#&※ 306.21 ± 21.13#&※ 72.04 ± 5.63#&※ 44.25 ± 2.97#&※ 61.54 ± 6.19#&※F 25.274 41.150 30.416 35.511 75.288 52.198 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 各组孕鼠子宫组织GATA-3、IL-4、T-bet 及IFN-γ mRNA 相对表达情况

与对照组比较，模型组孕鼠子宫组织中GATA-3、IL-4 mRNA 相对表达水平降低，T-bet、IFN-γ mRNA相对表达水平升高（P< 0.05）；与模型组比较，各给药组孕鼠子宫组织中GATA-3、IL-4 mRNA 相对表达水平升高，T-bet、IFN-γ mRNA 相对表达水平降低（P< 0.05）；与黄体酮组比较，TFCC 低、高剂量组孕鼠子宫组织中GATA-3、IL-4 mRNA 相对表达水平降低，T-bet、IFN-γ mRNA 相对表达水平升高（P<0.05）；与TFCC 低剂量组比较，TFCC 高剂量组孕鼠子宫组织中GATA-3、IL-4 mRNA相对表达水平升高，T-bet、IFN-γ mRNA 相对表达水平降低（P< 0.05），见表4。

表4 相关因子mRNA 相对表达水平比较（±s，n = 10）Tab. 4 Comparison of mRNA relative expression levels of related factors（±s，n = 10）

表4 相关因子mRNA 相对表达水平比较（±s，n = 10）Tab. 4 Comparison of mRNA relative expression levels of related factors（±s，n = 10）

组别 GATA-3 IL-4 T-bet IFN-γ对照组 0.98 ± 0.03 1.03 ± 0.07 0.99 ± 0.03 1.01 ± 0.07模型组 0.32 ± 0.05* 0.28 ± 0.08* 3.45 ± 0.75* 8.52 ± 1.82*黄体酮组 0.84 ± 0.07# 0.74 ± 0.11# 1.49 ± 0.58# 2.79 ± 1.13#TFCC 低剂量组 0.48 ± 0.05#& 0.42 ± 0.11#& 2.75 ± 0.51#& 6.09 ± 1.05#&TFCC 高剂量组 0.62 ± 0.05#&※ 0.58 ± 0.11#&※ 2.11 ± 0.46#&※ 4.19 ± 1.23#&※F 266.617 89.076 34.930 58.552 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 各组孕鼠子宫组织IL-4、IFN-γ 蛋白相对表达量

与对照组比较，模型组孕鼠子宫组织中IL-4 蛋白相对表达量降低，IFN-γ 蛋白相对表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，各给药组孕鼠子宫组织中IL-4 蛋白相对表达量升高，IFN-γ 蛋白相对表达水平降低（P< 0.05）；与黄体酮组比较，TFCC 低、高剂量组孕鼠子宫组织中IL-4 蛋白相对表达量降低，IFN-γ 蛋白相对表达水平升高（P< 0.05）；与TFCC低剂量组比较，TFCC 高剂量组孕鼠子宫组织中IL-4蛋白相对表达量升高，IFN-γ 蛋白相对表达水平降低（P< 0.05），见表5、图2。

表5 IL-4、IFN-γ 蛋白相对表达量比较（±s，n = 10）Tab. 5 Comparison of the relative expression levels of IL-4 and IFN-γ protein（±s，n = 10）

表5 IL-4、IFN-γ 蛋白相对表达量比较（±s，n = 10）Tab. 5 Comparison of the relative expression levels of IL-4 and IFN-γ protein（±s，n = 10）

组别 IL-4 IFN-γ对照组 0.81 ± 0.09 0.09 ± 0.03模型组 0.11 ± 0.02* 0.74 ± 0.06*黄体酮组 0.36 ± 0.05# 0.20 ± 0.04#TFCC 低剂量组 0.19 ± 0.04#& 0.46 ± 0.05#&TFCC 高剂量组 0.29 ± 0.04#&※ 0.32 ± 0.05#&※F 262.746 286.577 P 0.000 0.000

3 讨论

TFCC 为菟丝子主要活性成分，研究发现其可提高生殖激素相关受体、降低大鼠流产率、增加胚胎重量，减少子宫组织中蜕膜细胞损伤进而介导抗流产作用[8-9]。另有研究表明，胎儿早期流产孕妇血液中雌二醇水平比对照组低86.7%，黄体酮水平比对照组低70.2%，黄体酮与月经周期、着床有关，对维持妊娠至关重要，并可促进胎盘产生雌二醇，预防策略中黄体酮主要用于先兆流产、反复流产及早产，胎盘内分泌异常是胎儿胎盘功能障碍的标志[10]，故本实验选择黄体酮治疗作为阳性对照。结果显示，TFCC 作用效果虽弱于黄体酮，但也可呈剂量依赖性改善先兆流产孕鼠子宫组织结构及蜕膜细胞损伤，降低死胚数及流产率，提高活胚数量，并可显著提高血清黄体酮及雌二醇水平，提示TFCC 可能通过改善先兆流产大鼠子宫损伤及胎盘功能障碍进而改善先兆流产大鼠妊娠结局而发挥抗流产作用，对先兆流产预防或治疗同样具有积极意义。

妊娠期间，各种免疫效应因子和分子参与的免疫微环境建立了特定的母体对半异体胎儿的耐受性，其中Th1 免疫在胚胎着床期间占主导地位，以利于滋养细胞入侵；胎盘植入后，早期炎性Th1 免疫迅速向Th2 抗炎免疫转移，通过平衡Th1 免疫保护胎儿，并调节胎儿和胎盘的发育，Th1/Th2 平衡对于在母体-胚胎界面建立免疫耐受至关重要[11]。Th1 细胞主要产生促炎细胞因子如TNF-α、IFN-γ，可刺激细胞炎症并参与细胞免疫和排斥过程[12-13]；Th2 细胞因子主要为IL-4、IL-10 等，可激活B 细胞抗体的产生并拮抗Th1 细胞因子，对维持妊娠至关重要[14-15]。实验通过评估血清中上述因子水平，发现模型大鼠Th1/Th2 免疫失衡，经TFCC 治疗后，先兆流产孕鼠血清TNF-α、IFN-γ 水平降低，IL-4、IL-10 水平升高，提示TFCC 可能促进Th2 细胞因子免疫偏向，改善母体免疫耐受而发挥抗流产作用。T-bet 为Th1 细胞中特异性表达的转录因子，可诱导IFN-γ 产生并启动Th1 发育；GATA-3 是一种锌指蛋白，可在Th2 细胞中选择性表达，对所有Th2 细胞因子的转录调控至关重要，T-bet 上调及GATA-3 下调可提示免疫失衡，与流产相关[16]。实验中，模型孕鼠子宫组织中T-bet mRNA、IFN-γ mRNA 及蛋白相对表达水平升高，GATA-3 mRNA、IL-4 mRNA 及蛋白相对表达水平降低，表明先兆流产大鼠不良妊娠结局与免疫失衡并偏向Th1 免疫有关，TFCC 可有效逆转此情况。

4 结论

TFCC 可改善先兆流产大鼠子宫结构损伤、胎盘功能障碍及妊娠结局，其作用机制可能与调节Th1/Th2 平衡偏向Th2 免疫反应，进而恢复先兆流产大鼠免疫状态有关，提示先兆流产治疗药物的潜在靶点，也为TFCC 应用提供了参考资料，具有一定的临床试验价值。