基于HPLC法评价不同产地桑白皮中桑酮G、桑酮H的含量

刘萱,秦雯,李铮,张宪,杜小伟（.北京市药品检验研究院（北京市疫苗检测中心） 国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室,北京 006;.北京城市学院,北京 00083）

桑白皮为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮。秋末叶落时至次春发芽前采挖根部，刮去黄棕色粗皮，纵向剖开，剥取根皮，晒干。有泻肺平喘，利水消肿的功能。用于肺热喘咳，水肿胀满尿少，面目肌肤浮肿[1]。最早收载于《神农本草经》，列为中品[2]。桑白皮中含有多种化学成分，含伞形花内酯、东莨菪素和众多黄酮成分、桑根皮素、桑素、桑色烯、环桑素、环桑色烯等[3,6]。黄酮类化合物在调节机体免疫功能、改善心血管与内分泌等方面具有显著的药理活性[4-5,7]。本研究采用高效液相色谱法对桑白皮中桑酮G、桑酮H含量进行研究。

1 仪器与试药

恒温水浴锅（Yamato Water Bath，BS600）、水循环冷却器（LabTeach，H35）、冰箱（Haier）、电子天平（BSA822-CW；CPA225D）、紫外光度仪（SHIMADZU，UV-2600），超纯水机（MILLIPORE，Milli-Q）、真空泵（ROCKER420）、超声波清洗仪（BRANSON8510）、高效液相色谱仪（Waters2695）、色谱柱（Agilent Eclipse XDB C18（4.6mm×250mm，5μm）、桑酮G、桑酮H对照品、（成都瑞芬思生物科技有限公司）、乙腈（默克JA057930）、甲醇（默克MA01821）、样品收集情况（见表1）。

表1 桑白皮药材信息

2 实验部分

2.1 对照品溶液的制备 精密称取桑酮G8.6mg，桑酮H8.4mg，分别置于25ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各2ml，分别置于10ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1ml含桑酮G68.8 g、桑酮H67.2 g的溶液，见图1-3。

图1 桑酮G对照品色谱图

2.2 供试品溶液的制备 取桑白皮药材粉末（过二号筛）（YC-1）约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量。加热回流30min，立即冷却，再称定重量。用70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图4。

图4 桑白皮供试品色谱图

3 方法学考察

3.1 线性关系 精密称取桑酮G8.6mg，桑酮H8.4mg，置于同一25ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取混合对照品溶液0.4 l、1 l、2 l、4 l、5 l、10 l，按色谱条件依次进样，分别记录色谱图。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线。结果表明桑酮G、和桑酮H 的线性关系均良好。回归方程分别为，桑酮G：y=2×106x+4.315×103，R1=0.9999，桑酮H：y=8.249×105x-6.281×103，R2=0.9999，结果见表2。

表2 桑酮G、桑酮H峰面积与浓度

3.2 精密度试验 取桑白皮药材（YC-1）0.5g，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制样，按色谱条件连续进样6次，记录色谱图及峰面积，计算峰面积RSD。桑酮G：RSD=0.09%；桑酮H：RSD=0.89%。表明精密度良好。

3.3 稳定性试验 取桑白皮药材（YC-1）0.5g，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制样，按色谱条件分别在0h、2h、8h、12h进样，记录色谱图及峰面积，计算峰面积RSD。桑酮G：RSD=0.37%；桑酮H：RSD=0.18%。结果表明，供试品溶液在12小时内稳定。

3.4 重复性试验 取桑白皮药材（YC-1）0.5g，精密称定，按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制样，按色谱条件依次进样，记录色谱图及峰面积，计算峰面积RSD。结果桑酮G平均含量7.553%，RSD为1.90%，桑酮H平均含量3.152%，RSD为1.63%（n＝6）。结果表明，该方法重复性良好。

3.5 回收率试验 取已知含量的桑白皮药材（YC-1）（桑酮G7.553%，桑酮H3.152%）0.5g，精密称定，精密加入25ml对照品溶液（桑酮G浓度：0.0688 g/ml，桑酮H浓度：0.0672 g/ml），按色谱2.2制备方法制备并分析，计算加样回收结果。结果表明，本测定方法回收率良好。见表3。

表3 桑酮G、桑酮H回收率测定结果

3.6 其他样品测定结果 见表4。

表4 其他样品测定结果

4 讨论

4.1 色谱条件的考察

4.1.1 检测波长的选择 取桑酮G、桑酮H对照品溶液，在210-400nm扫描紫外光吸收光谱。发现两个对照品在265nm下，基线噪音均较低。特征峰响应值均较高。因此，选择265nm为检测波长。

图2 桑酮H对照品色谱图

图3 桑酮G、桑酮H混合对照品色谱图

4.1.2 流动相的选择 采用A g i l e n t E c l i p s e X D B C 1 8（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱。流速、时间及洗脱溶液比例等见表5-6，柱温30℃，检测波长265nm，进样体积10μl。

表5 流动相洗脱时间考察

结果采用表6洗脱时间短，分离效果好，故此选择表6方法作为最终方法。

表6 流动相洗脱时间考察

4.2 供试品溶液制备方法的考察

4.2.1 提取溶剂考察 取桑白皮药材（YC-1）0.5g，精密称定，置于100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入乙醇，70%乙醇，稀乙醇，甲醇，70%甲醇，50%甲醇各50ml，称定重量，超声处理（功率100W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用相应试剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按上述色谱条件进行测定，结果表明，用70%甲醇提取桑酮G、桑酮H峰面积均为最高，故本实验选用70%甲醇作为提取溶剂。

4.2.2 提取方式的考察 取桑白皮药材（YC-1）0.5g，精密称定。分别精密加入70%甲醇50ml，分别采用回流30min与超声（功率100W，频率40Hz）提取30min的方法提取，制备样品溶液，测定，结果表明，回流提取各成分的含量较高，故选择回流提取。

4.2.3 提取时间的考察 取桑白皮药材（YC-1）0.5g，精密称定。精密加入70%甲醇50ml，称定重量。分别回流提取15min、30min、1h、1.5h，回流后立即冷却，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，进行测定，实验结果表明，回流时间为30min时检测到各成分含量较高，故选择的提取时间为回流提取30min。

4.3 不同产地样品的含量测定结果 样品测定结果显示不同产地对桑白皮中桑酮G、桑酮H的含量影响较大。其中产地为河南省的桑白皮样品中桑酮G、桑酮H值均较高。与传统道地产区相近。

4.4 不同色谱柱测定结果 取同一样品分别选取：Kromasil（250×4.6mm）E10611，KR100-5C18色谱柱；Agilent Eclipse XDB C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；Phenomenex Gemini 5μ C18 110A（250×4.6mm，5micron）300268-1色谱柱。分别进行测定，RSD为2.35%。

4.5 本研究采用回流方式进行提取，提取完成后曾放至自然冷却。发现效果不佳，后改进为回流提取后立即冷却，结果显示效果良好。说明桑白皮中的桑酮类成分桑酮G、桑酮H对热敏感。本研究建立的桑白皮中黄酮类成分的含量测定方法快速，灵敏度高，重复性和稳定性好，可作为桑白皮药材和饮片的质量评价方法之一。