全外显子组测序筛选1个人类白细胞抗原-B27阴性强直性脊柱炎家系的强直性脊柱炎易感基因

任伟凡，辛大伟，胡劲涛，吴风晴，周化腾，杜伟斌，全仁夫

（1．杭州市萧山区中医院，浙江 杭州 311201；2．浙江中医药大学附属杭州市中医院，浙江 杭州 310007）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种自身免疫性疾病，患病率为 0．1% ～1．4%。AS主要累及中轴骨，临床表现早期主要为后背疼痛和僵硬，晚期主要为脊柱关节强直。AS的发生是遗传、环境和免疫等因素相互作用的结果，而遗传因素起着重要作用。研究表明，人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-B27基因与 AS易感性强相关。临床上 AS患者中约90%为 HLA-B27阳性，但HLA-B27基因仅占AS遗传度的23%。因此，可以推测还存在其他基因影响AS的发生。为了筛选其他AS易感基因，我们对一个HLA-B27阴性AS家系中的3名成员的基因组进行了全外显子组测序，并对测序数据进行了分析，现总结报告如下。

1 临床资料

纳入1个AS家系的15名核心成员，均为HLAB27阴性，其中AS患者2例，其余均正常。先证者，女，58岁，符合美国风湿病学会1984年修订的纽约标准；先证者女儿，35岁，符合1991年欧洲脊柱关节病研究组提出的脊柱关节病的诊断标准。试验方案经医院医学伦理委员会审查通过。

2 方 法

2．1 全外显子组测序及测序数据分析

采集AS家系15名核心成员的外周血，提取外周血基因组。将先证者、先证者女儿、先证者儿子的外周血基因组进行全外显子组测序（广州基迪奥生物科技有限公司）。将原始测序数据通过过滤和质量控制后获得有效数据，统计捕获目标区域长度、有效测序片段数量、有效数据大小、目标区域有效数据大小；采用BWA工具将外显子序列比对到人类参考基因组，获得比对结果，计算比对率（测序片段比对到的参考基因组在参考基因组中所占的比例）及捕获效率（比对到目标区域的序列在比对到参考基因组的序列中所占的比例）。采用SAMtool软件将比对结果输出为BAM格式文件，采用Picard软件标记重复测序片段，统计测序深度及测序片段覆盖度。

2．2 AS易感基因筛选

采用GATK软件挖掘单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）突变信息，采用ANNOVAR软件注释分析SNP突变，参照以下步骤筛选AS易感基因：①剔除外显子和剪接区以外的突变；②剔除外显子和剪接区内的同义突变；③剔除千人基因组数据库中突变频率≥0．01的突变；④剔除外显子组整合数据库中突变频率≥0．01的突变；⑤采用 SIFT、Polyphen、MutationTaster、MutationAssessor、M-CAP、FATHMM、CADD等软件进行蛋白损伤预测，选择至少有4个软件的预测结果显示为有害的突变；⑥保留患者共有而正常人不具有的变异；⑦确定AS易感基因名称、位置及突变类型。

2．3 AS易感基因验证

根据筛选出的易感基因设计引物，分别以15名AS家系核心成员的基因组为模板，扩增目的基因。采用琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，并对目的基因进行Sanger测序（华大基因科技有限公司），确定存在该移码突变的成员。

3 结 果

3．1 全外显子组测序数据分析结果

全外显子组测序获得了较高质量的测序数据，具体数据分析结果见表1。

表1 全外显子组测序数据分析结果

3．2 AS易感基因筛选结果

RELA基因10号外显子上存在一个杂合移码突变c．1039delG（图1），突变的RELA基因可能为AS易感基因。

图1 移码突变c．1039delG测序峰图

3．3 AS易感基因验证结果

根据RELA基因设计引物：正向引物，5’-AACTAAGTCCTGAGAGGCAAT-3’；反向引物，5’-TGAGAACTGACCTAGCCCTT-3’。Sanger测序结果显示，先证者、先证者女儿及先证者孙子的基因组上存在RELA基因移码突变，其他家系成员不存在该突变。

4 讨 论

AS具有一定的家族遗传性，以15～35岁为发病高峰。目前，AS的发病机制尚未完全明确。多项研究显示，HLA-B27基因与 AS的发生强相关。Qian等的研究结果表明，在 AS患者中，HLAB27阳性患者的发病时间早、临床症状重。然而，HLA-B27基因仅占AS遗传度的23%。因此，应该还存在其他AS易感基因。本研究的家系成员均为HLA-B27阴性，其中有2例AS患者；这2例患者的发病时间均在30岁以后，且腰部疼痛不剧烈、晨僵症状时而好转。通过外显子组测序及数据分析，结果显示该家系中可能存在其他的AS易感基因。

核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）是细胞中重要的转录因子，与炎症反应、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等过程密切相关。NF-κB蛋白以与NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）结合的状态存在于细胞质中，外界刺激促使IκB磷酸化、泛素化，进而被蛋白酶体降解，随后NF-κB蛋白进入细胞核并与靶基因结合，调控基因转录。NF-κB家族包括RelA（p65）、RelB、NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）和c-Rel 5位成员。除了RelB，其他成员均能形成同源或异源二聚体，其中p50／p65异源二聚体最为常见，几乎存在于所有有核细胞中。NF-κB家族成员均含有Rel同源结构域，该结构域含有300个氨基酸，具有特异性DNA序列结合、二聚化和抑制蛋白结合3个功能。p65包含Rel同源结构域、连接区及拓扑结构域，其中拓扑结构域主要负责p65的转录活性调节。

AS的主要病理表现为炎症介导的骨破坏和病理性骨形成。NF-κB信号通路是典型的炎症信号转导通路。炎症性肠病、类风湿关节炎、牛皮癣、哮喘、全身炎症反应综合征等多种疾病与NF-κB信号通路密切相关。在多种炎症性疾病中，NF-κB能够被激活并持续表达，而NF-κB的表达可进一步诱导促炎性细胞因子、趋化因子、黏附因子、基质金属蛋白酶等多种蛋白的表达。Mulero等研究发现，多种炎症性疾病患者体内NF-κB活性增加，同时炎症细胞募集增加，白细胞介素（interleukin，IL）-8、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎性细胞因子表达量增加。韩飞等采用实时定量PCR检测类风湿关节炎患者、骨关节炎患者和健康成人的滑膜组织中NF-κB的mRNA表达，结果显示类风湿关节炎患者的NF-κB mRNA表达量显著高于骨关节炎患者和健康成人；采用原位免疫组织化学染色法检测p65在细胞核中的表达，结果显示类风湿关节炎患者p65的活性系数（细胞核p65阳性百分比／细胞质p65阳性百分比）显著高于骨关节炎患者和健康成人。方利等采用酶联免疫吸附分析法检测了30例AS患者（试验组）和30位健康志愿者（对照组）外周血血清中NF-κB信号通路相关蛋白的表达量，结果显示试验组患者外周血血清中TNF-α、IL-1β、IL-17、NF-κB激活剂 1、p65、p50、IκBα、IκB激酶 β、颗粒膜蛋白140、血小板活化因子、血栓素A2的含量均显著高于对照组，提示AS患者体内NF-κB信号通路处于激活状态。除了参与炎症反应，NF-κB对成骨细胞和破骨细胞代谢具有一定的调节作用。在关节炎和骨质疏松症的相关研究中，激活的NF-κB能够抑制成骨细胞骨形成，促进破骨细胞骨吸收，并能够影响软骨细胞的增殖与分化，抑制NF-κB表达能够发挥抗炎和抗骨质溶解的作用。

既往研究AS易感基因多以全基因组关联分析为主，目前已发现50多种基因与AS相关。但是针对1个家系的研究，由于患病人数和突变基因携带者较少，不宜采用连锁分析或关联分析的方式。而采用Sanger测序法逐个验证候选基因，成本较高、周期较长。随着高通量测序技术的发展，将全基因组测序和全外显子组测序用于单个家系和散发病例的致病基因研究，具有一定的优势。Liu等采用全外显子组测序联合基因筛查在1个家族性房间隔缺损家系中发现新的致病突变TBX20。外显子仅占整个基因组的1%，但约85%的致病突变都位于外显子上。相较于全基因组测序，外显子组测序的费用低、耗时少、效率高。此外，全外显子组测序能够较为准确的确定候选基因，便于后续的基因筛选和功能鉴定。

移码突变是指基因编码区内缺失或增加的核苷酸数目不是3的倍数从而造成阅读框移动的突变。由于阅读框移动，导致突变位点后的氨基酸组成种类和顺序都发生了改变，进而影响蛋白的结构和功能。本研究结果显示，RELA基因10号外显子上存在一个杂合移码突变c．1039delG。RELA基因位于11号染色体，有10个外显子，编码p65蛋白。RELA基因发生该移码突变会导致p65蛋白拓扑结构域发生变化，从而影响p65的转录活性，影响NF-κB信号通路的信号转导。AS易感基因的验证结果显示，先证者、先证者女儿及先证者孙子的基因组上均存在该突变。RELA基因突变可能是导致该家系AS发生的重要遗传因素。先证者孙子尚未出现AS临床症状，可能与其未到发病年龄有关。但需提醒其注意自身身体状况，如出现AS临床症状，应尽早干预以避免病情恶化。本研究结果表明，突变的RELA基因可能是该AS家系的AS易感基因。