Na+、K+、Ca2+、Mg2+、葡萄糖和甘油浓度对拟赤梢鱼精子活力的影响

王雨，杨建，耿龙武，张宇婷，徐伟，丛艳锋，杜汝君

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.黑龙江省冷水性鱼类种质资源及增养殖重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150070；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；4.杜尔伯特蒙古族自治县水产总站，黑龙江 大庆 166200）

拟赤梢鱼（Pseudaspius leptocephalus）隶属鲤科（Cyprinidae）、雅罗鱼亚科（Leuciscinae）、拟赤梢鱼属（Pseudapius）的唯一种[1]，在我国仅分布于黑龙江流域，是肉质细腻、味道鲜美的黑龙江流域名贵淡水经济鱼类[2]。近年来，环境污染、产卵场破环、过渡捕捞等导致拟赤梢鱼资源明显衰退，亟需保护。目前，关于拟赤梢鱼的研究仅见核型分析[3]、肌肉营养成分[4]和人工繁育[5]等。

鱼类精子活力与其受精能力密切相关，提高精子活力有利于提高人工繁殖的受精率[6]。精子活力主要通过精子激活率、精子运动激烈程度和运动时间等指标来反映，是检测精子质量的重要指标[7]。研究表明，渗透压、pH、温度、离子等环境因子对鱼类精子活力的影响显著[8]，其中，渗透压是影响大多数鱼类精子运动能力的主要因素。Na+、K+、Ca2+、Mg2+是维持鱼类精浆渗透压的主要离子，不同种离子对同种鱼类精子活力的影响及同种离子对不同种鱼类精子活力的影响均存在差异[9]。如K+能抑制鲑鳟鱼类精子的活动，而在鲤科鱼类中能够提高精子运动速度[10-12]。近年来，随着鱼类配子和胚胎冷冻保存研究的进一步深入，糖类物质、磷脂作为冷冻稀释液中基础溶液的重要组分，在形成渗透压、提供外源营养中起着不可替代的作用[13]。葡萄糖可显著延长凹目白鲑（Coregonus autumnalis）精子寿命[14]。本研究通过分析对比不同浓度无机离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+和葡萄糖、甘油有机溶剂中拟赤梢鱼精子活力变化规律，旨在阐明不同环境因子对拟赤梢鱼精子活力的影响，并为拟赤梢鱼精子生理学研究和人工繁殖提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验鱼为随机采取的6 尾5 龄成熟度好、健康无伤的拟赤梢雄鱼，平均体长为（26.86±0.85）cm，体质量为（194.03±18.27）g，取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验站。用促黄体生成激素释放激素类似物（LRH-A2）2.0 μg·kg-1和马来酸地欧酮（DOM）0.5 mg·kg-1对雄鱼样本进行人工催产，胸腔注射1 次，28 h 后，用干燥洁净的毛巾擦去鱼体表面及生殖孔附近的水分，轻压鱼腹部流出精液，滴入干燥洁净的2 mL 离心管中，立即置于4℃环境中保存备用。精液采集过程中应避免尿液、血液和粪便污染精液。

用去离子水和分析纯氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、葡萄糖和甘油分别配制不同浓度梯度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、葡萄糖及甘油激活液，不同激活液浓度设计见表1，以去离子水作为对照组。

表1 不同梯度激活溶液设计Tab.1 The design of different gradient activation solutions

1.2 精子活力观察与测定

移液枪吸取2 μL 新鲜精液于载玻片上，再吸取精子激活液20 μL 加至精液中，迅速用枪头将其搅匀，无需加盖盖玻片，同时用秒表计时，于10×10倍显微镜（BX1 OlyMpus Microscope）下观察。观察过程以一个视野为准。精子活力观察标准参照乔志刚等[15]、苏德学等[16]划分的等级标准：精子激活率（Activation rate）以激活起始时给定视野内被激活精子数量占全部精子数量的百分数计算；精子快速运动时间（Fast Movement period，FMP）以精子激活开始至70%的精子能看清运动轨迹的时间计算；精子运动时间（Moving duration，MD）以精子激活开始至90%的精子原地颤动为止的时间计算；精子寿命（Life span，LS）以精子激活开始至90%的精子停止运动为止的时间计算。精子活力观察与测定由同一人用相同方法完成，不同实验处理组各样品测定3次，取平均值。

1.3 数据分析

结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示，用SPSS22.0 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan 法进行多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 Na+对精子活力的影响

在0.02～0.14 mol·L-1的Na+激活液中，拟赤梢鱼精子激活率在0.02～0.06 mol·L-1时差异不显著（P>0.05），在0.08 mol·L-1时虽显著降低，但仍维持在80%以上。随着Na+浓度的升高，拟赤梢鱼精子的FMP、MD 和LS 均先增加后减少，其中0.14 mol·L-1浓度组拟赤梢鱼精子的FMP、MD 和LS 小于对照组。而在0.08 mol·L-1浓度组激活液中，拟赤梢鱼精子的FMP、MD 和LS 均大于其他组，FMP、MD 和LS分别为（26.87±0.69）s、（74.49±7.19）s 和（446.48±21.96）s（表2）。

表2 拟赤梢鱼精子在不同浓度NaCl 溶液中的活力Tab.2 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of NaCl solution

2.2 K+对精子活力的影响

在K+浓度为0.02～0.14 mol·L-1范围内，随K+浓度的升高拟赤梢鱼精子的激活率降低，浓度为0.08 mol·L-1时，拟赤梢鱼精子的激活率显著降低（P<0.05）。在K+浓度为0.02～0.14 mol·L-1范围内，精子FMP、MD 和LS 随K+浓度的升高先增加后降低，浓度为0.10 mol·L-1组时，精子FMP、MD 和LS达到峰值，分别为（25.73±0.44）s、（55.53±4.38）s和（183.19±11.80）s。在K+为0.14 mol·L-1组中，拟赤梢鱼精子的FMP、MD 和LS 显著小于对照组（P<0.05）（表3）。

表3 不同浓度KCl 溶液中拟赤梢鱼的精子活力Tab.3 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of KCl solution

2.3 Ca2+对精子活力的影响

在Ca2+浓度为0.003～0.021 mol·L-1的范围内，拟赤梢鱼精子激活率、FMP、MD 和LS 均随Ca2+浓度的增加而减少，精子聚集程度也不断增加。实验组精子激活率均显著小于对照组（P<0.05），0.003 mol·L-1时精子激活率已降至（56.68±5.77）%；而精子的FMP、MD 和LS 仅在Ca2+为0.003 mol·L-1组的激活液中与对照组水平无显著差异（P>0.05），分别为（15.97±0.56）s、（31.63±1.93）s、（48.12±1.74）s（表4）。

表4 不同浓度CaCl2 溶液中拟赤梢鱼的精子活力Tab.4 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of CaCl2 solution

2.4 Mg2+对精子活力的影响

随着溶液中Mg2+浓度的升高，拟赤梢鱼精子的激活率、FMP、MD 和LS 均随着Mg2+浓度的升高而逐渐降低。其实验组的精子激活率均显著小于对照组（P<0.05），且在Mg2+为0.021 mol·L-1组激活率为0%，而精子的FMP、MD 和LS 在0.003～0.009 mol·L-1浓度范围内均高于对照组。在0.002 mol·L-1组的激活液中，精子的激活率、FMP、MD 和LS 分别为（57.21±2.72）%、（17.65±0.68）s、（35.74±1.61）s和（66.31±5.19）s（表5）。

表5 不同浓度MgCl2 溶液中拟赤梢鱼的精子活力Tab.5 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of MgCl2 solution

2.5 葡萄糖对精子活力的影响

在葡萄糖浓度为0.22 mol·L-1组中，拟赤梢鱼精子的激活率为（83.33±2.78）%，小于对照组拟赤梢鱼精子的激活率；而葡萄糖浓度为0.30 mol·L-1组的激活液中，精子的激活率降为0%。在葡萄糖浓度为0.06～0.22 mol·L-1的范围内，拟赤梢鱼精子的FMP、MD 和LS 随着葡萄糖浓度的升高而增加，在浓度为0.22 mol·L-1组中达最大值，分别为（25.51±1.84）s、（52.14±3.93）s、（76.74±4.05）s（表6）。

表6 不同浓度葡萄糖溶液中拟赤梢鱼的精子活力Tab.6 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of Glu solution

2.6 甘油对精子活力的影响

在不同浓度甘油激活液中，精子的激活率显著小于对照组（P<0.05），在甘油浓度为0.30 mol·L-1组中，精子的激活率为0%。在甘油浓度为0.06～0.22 mol·L-1范围内，拟赤梢鱼精子的运动能力同在葡萄糖激活液中变化一致，均随浓度的升高而增加，精子的FMP、MD 和LS 均在浓度为0.22 mol·L-1的激活液中达最大值，分别为（27.01±1.34）s、（48.16±7.41）s 和（90.54±2.75）s（表7）。

表7 不同浓度甘油溶液中拟赤梢鱼的精子活力Tab.7 Sperm motility of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of Gly solution

3 讨论

3.1 无机离子对精子活力的影响

鱼类精子释放到外界环境时，其所处的环境渗透压发生变化，立即被激活[17]。激活后的精子大部分能量用于渗透压调节[18]。当精细胞内外渗透压差逐渐减小时，用于自身渗透压的能量消耗随之减少，能量多用于维持精子的运动[6]。

Na+、K+是维持精浆渗透压的主要离子，在影响精子活力方面发挥重要作用。Na+可以通过诱发细胞膜去极化产生动作电位，引起细胞内Ca2+浓度的变化，间接激活精子运动，也使运动强烈程度增大[19]。本研究中，在Na+、K+浓度为0.02～0.12 mol·L-1的范围内拟赤梢鱼精子的运动状态均不同程度提高，而在0.14 mol·L-1时受到抑制，这说明一定浓度的Na+、K+对拟赤梢鱼精子活力具有促进作用，当超过某一限制浓度时就会出现抑制。这一结果与对马口鱼（Opsariicjthys bidens）[20]、高白鲑（Coregouns peled）[21]和四川裂腹鱼（Schizothorax kozlovi）[22]等鱼类精子活力的研究结果一致。

本研究中，Na+、K+激活液浓度为0.02～0.12 mol·L-1时，其均对拟赤梢鱼的精子活力具有促进作用，其中最适Na+浓度为0.08 mol·L-1。在该浓度下拟赤梢鱼精子运动状态最佳，尤其是精子寿命显著延长。研究证实，大鳞鲃（Barbus capito）、稀有鲫（Gobiocypris rarus）等鱼类的精子激活剂中Na+的最适浓度与本研究中拟赤梢鱼的最适Na+浓度较为接近，分别为0.085 mol·L-1和0.09 mol·L-1[23,24]，而高体雅罗鱼（Leuciscus idus）精子最适Na+浓度则为0.135 mol·L-1[25]，这表明不同种鱼类精子激活液中Na+浓度不同。拟赤梢鱼精子活力的三个运动指标均在浓度为0.10 mol·L-1的K+激活液中为最高，但此时其精子的激活率低于80%，不利于实际生产应用。本研究中，拟赤梢鱼精子最适K+浓度为0.08 mol·L-1，低于同属鲤科鱼类大鳞鲃精子的最适K+浓度0.13 mol·L-1[23]，而中华鲟（Acipenser sinensis Gray）精子的最适K+浓度仅为0.005‰[26]。可见，不同种鱼类精子的最适K+浓度差异较大。

本研究中，精液激活剂中Ca2+、Mg2+对拟赤梢鱼精子活力的作用方式与Na+、K+不同。其中，高Ca2+、Mg2+浓度的激活液显著抑制精子的激活率，而精子快速运动时间、运动时间及寿命也随着Ca2+、Mg2+浓度的升高逐渐降低。翘嘴鲌（Erythroculter ilishaeformis）精子在Ca2+、Mg2+浓度为0.001～0.003 mol·L-1范围内，其激活率高于对照组[27]，是否在更低浓度范围内同样存在拟赤梢鱼精子最适浓度，尚需进一步的实验来证明。与白斑狗鱼（Esox lucius）[28]、萨罗罗非鱼（Sarotherodon melanotheron Rüppell）[29]等研究结果一样，本研究中Ca2+、Mg2+也可引起拟赤梢鱼精子的聚集。苏德学等[28]认为，精子聚集不是由于渗透压作用，而是Ca2+本身影响精子的生理生化过程。罗明坤等[29]还推测Ca2+能损伤精子内部结构，引起精子聚集，导致活力下降。本研究显示，Mg2+对拟赤梢鱼精子运动状态的抑制作用不及Ca2+，龚进玲等[30]的研究同样报道了达氏鲟（Acipenser dabryanus Dumeril）精子对Ca2+、Mg2+敏感性不一。

3.2 葡萄糖、甘油对精子活力的影响

本研究发现，葡萄糖与甘油对拟赤梢鱼精子活力的影响作用相似，在一定浓度范围内，均可显著延长精子的运动时间及寿命。目前关于葡萄糖、甘油显著延长鱼类精子运动时间及寿命的调控机制尚未明确。Gardiner[31]推测，体外受精鱼类精子具有三羧酸循环代谢的能力，可以通过氧化作用利用细胞外源性碳水化合物，延长精子寿命。

不同鱼类精子最适葡萄糖、甘油浓度差异较大。澳洲鳕鲈（Maccullochella peelii peelii）精子在0.27 mol·L-1的葡萄糖浓度下活力及存活时间显著延长[32]，而厚唇裂腹鱼（Schizothorax irregularis）最适葡萄糖浓度为0.17 mol·L-1、最适甘油浓度为0.13 mol·L-1[33]。在本研究中，在0.22 mol·L-1的葡萄糖、甘油激活液中拟赤梢鱼精子运动状态显著延长，但在之后的0.30 mol·L-1激活液中精子活力骤降，是否在0.22～0.30 mol·L-1浓度范围内存在更佳适宜的浓度，还需进一步验证[34]。拟赤梢鱼繁殖期短，其精液质量及精子活力在繁殖期后期显著下降，本研究尚未做进一步验证。

3.3 结论

综上所述，激活剂中Na+、K+浓度范围为0.02～0.12 mol·L-1时可提高拟赤梢鱼精子活力，0.14 mol·L-1时则出现抑制作用。其中，拟赤梢鱼精液激活剂中精子活力最适的Na+、K+浓度均为0.08 mol·L-1；与Na+、K+的激活作用不同，低浓度的Ca2+、Mg2+（0.003～0.021 mol·L-1）明显抑制拟赤梢鱼精子的激活，因此在生产中应避免使用高Ca2+、Mg2+含量的水体，以免抑制精子发挥作用。葡萄糖和甘油浓度为0.22 mol·L-1的激活剂中，拟赤梢鱼精子运动时间及寿命显著延长，为拟赤梢鱼人工繁殖中提高精子活力以及精子冷冻保存液的配制提供了基础数据。