幽门螺杆菌抗生素异质性耐药研究进展

目前，由于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，

)对抗生素的耐药问题日趋严重，导致其根除率在全球不少国家和地区均处在低于80%的欠理想水平

。异质性耐药(heteroresistance)是细菌不同亚群具有不同耐药性的现象，多见于铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等革兰氏阴性细菌中

。机制复杂的异质性耐药现象是导致针对致病菌感染的抗生素治疗失败的重要因素，多年来一直是抗感染治疗领域的一个研究热点

。近年来，随着对

异质性耐药研究的不断深入，

对抗生素的异质性耐药问题逐渐被学术界关注

。有研究

相继报道了

在各地区对克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星等抗生素异质性耐药的情况，提示

异质性耐药已较为常见，应受到临床的重视

。关于

异质性耐药的机制，现有的报道认为

异质性耐药形成的原因可能与感染不同

菌株

、基因改变

、

在胃内定植部位变化

等众多因素有关。尽管有报道称可检测

异质性耐药的方法有多种，如：菌群谱分析法(population analysis profiling, PAP)、微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、荧光免疫杂交等，但仍缺乏规范化和标准化的检测方法，导致其检测效果并不理想，可能会低估

异质性耐药的程度

。本文主要就

异质性耐药可能的形成机制及目前的检测方法作一概述，旨在加深对

异质性耐药的认识，为临床提高

根除率提供新的思路。

1 异质性耐药

异质性耐药最初在1947年被描述，直到1970年才被首次报道，这种现象在革兰氏阳性、阴性细菌中均有发现

，但到目前为止，异质性耐药并无统一的定义。广义的异质性耐药是指细菌群体中一个或数个亚群与主要群体相比，表现出对抗生素更高的耐药性

。El-Halfawy等

给出了异质性耐药更具临床意义的定义，即在细菌群体中一部分细菌亚群相比主要群体，其对某种抗生素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)值显著增加(至少8倍)。在该定义下，El-Halfawy等

进一步通过在抗生素2倍增量的梯度浓度下设置细菌标准耐药的临界浓度，若抗生素对部分亚群的抑菌浓度高于此临界值，则认为该亚群耐药，并将细菌群体对抗生素的异质性描述分为三类：(1)细菌群体对抗生素敏感，即在低于临界值的抗生素浓度下，耐药性最强的细菌亚群对抗生素也表现为敏感；(2)细菌群体对抗生素耐药，即群体中耐药性最弱的亚群在高于临界值的抗生素浓度下也表现为耐药；(3)典型的异质性耐药形式，即细菌群体中大多数亚群在低于临界值的抗生素浓度下表现为敏感，而少数亚群可以耐受高于临界值的抗生素浓度，这种典型的异质性耐药临床意义最大

。Andersson等

在此基础上，建议在定义不同细菌的异质性耐药时，应注意描述以下4个特征：(1)耐药亚群的克隆性；(2)耐药亚群的耐药水平；(3)耐药亚群的频率；(4)耐药亚群的稳定性。其中，区分多克隆异质性耐药和单克隆异质性耐药对于研究异质性耐药形成的原因十分重要

。多克隆异质性耐药包括对抗生素不同敏感性的菌株感染和罕见的耐药突变两种情况

。多克隆异质性耐药细菌群体中的耐药亚群一般是稳定的，可以将耐药性传递给子代

。而单克隆异质性耐药由细菌群体内的异质性引起，这种耐药性通常不稳定，在维持数代后常常丢失其耐药性，即抗生素存在时，细菌群体中耐药细菌的比例增加，但当抗生素浓度下降，耐药细菌比例又会降低

。有学者认为单克隆异质性耐药可能与持久性细胞(persister cells)的形成有关

。除此之外，Nicoloff等

进一步将异质性耐药进行限定：细菌群体中耐药亚群的比例应≥10

，以此能够更合理地描述异质性耐药。

有观点认为，异质性耐药可能是细菌对药物由敏感发展到耐药的中间阶段

。相较于常规药敏试验结果(敏感、耐药或中介)，异质性耐药更强调这些状态之间的转化和过渡

。异质性耐药可能与抗生素治疗失败和细菌反复感染有关，对临床的诊治具有重要影响，因此，异质性耐药的相关问题日益引起学术界的重视

。

2 H.pylori异质性耐药形成的原因

在2015年的感染人数接近40亿，约占世界总人口的50%，在发展中国家具有更高的感染率

。

感染是导致宿主慢性胃炎和消化性溃疡等疾病的主要原因，也可诱发胃癌和胃黏膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)淋巴瘤等恶性疾病

。近年来随着

对抗生素的耐药率上升，导致大部分根治方案的根除率欠理想，这成为临床上根治

的一大难题

。目前越来越多的研究提示，

中同时存在耐药和敏感的亚群是抗生素治疗失败的重要原因之一，

异质性耐药的研究具有重要的临床意义

。

尽管目前国内外均缺少

异质性耐药的大样本流行病学资料，但现有的研究已经证实在不同地区

对克拉霉素、左氧氟沙星等常用抗生素存在异质性耐药现象

。Mi等

在我国贵阳市地区48例

阳性患者中经筛选发现，

异质性耐药7例，涉及克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星及甲硝唑。Wang等

研究发现，在我国南昌市地区124例患者中

异质性耐药情况为：克拉霉素23例(18.5%)、左氧氟沙星25例(20.2%)。Sun等

在河南地区的研究发现，

对克拉霉素异质性耐药情况为：43例

阳性患者经浓度梯度法(E-test)发现14例，胃黏膜样本经ddPCR发现13例，粪便ddPCR结果显示12例。Kao等

在我国台湾地区412例患者中收集了19对具有异质性耐药的

感染病例，包括左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑。而我们的研究通过药敏实验和PCR扩增23S rRNA鉴定发现在甘肃地区112例

感染患者中有4例对克拉霉素异质性耐药，低于国内同类报道

，这可能与地域差异以及检测方法不同有一定关系。以下为国外的一些研究数据:Selgrad等

在德国66例患者中检测出10例患者的胃窦和胃体的

对克拉霉素等抗生素具有不同的敏感性。Farzi等

在伊朗地区的研究结果为：17.5%(7/40)的患者表现为胃窦和胃体

菌株对克拉霉素耐药的异质性。此外，一项包括亚洲、欧洲、非洲及美洲部分地区的荟萃分析表明，

对克拉霉素和甲硝唑的异质性耐药的发生率分别为6.8%和13.8%

。如上述，

异质性耐药现象并不少见

。

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在形态上分为两种，一种是螺旋状的B型

，其表面光滑，鞭毛盘绕在自身周围，并具有严格意义的膜状结构。另一种是类球体形态的A型

，也称为Coccoid形式，其胞膜和胞质的结构不规则且相互粘附，不具有严格意义上的膜性结构，此外，A型

中部分细菌新陈代谢缓慢甚至停滞，处于非增殖期，这可能是

的一种持久性形式

。在

根除治疗期间，当抗生素浓度接近MIC时，一些螺旋状形态的B型

会转变为类球体形态的A型

。Costa等

发现，内肽酶(endopeptidase)参与了

形态的转变，且内肽酶可水解

细胞壁抗生素靶蛋白，使A型

对作用于细胞壁的抗生素有一定的耐药性。并且代谢停滞的A型

可对作用于细菌繁殖期的抗生素产生耐药性

。此外，Faghri等

发现，

从B型到A型形态的改变与N-乙酰-D-氨基葡萄糖-β(1,4)-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-Glu(GM二肽)的积累有关。GM二肽积累的A型

可能对阿莫西林具有耐药性

。

关于不同

感染的相关概念，一些学者将其分为多重感染和混合感染。二者均意在描述

不同耐药性或毒力的亚群在胃内同一或不同部位的同时感染状态

。尽管不乏相关文献报道，但不同文献描述的概念难以将二者严格区分。并且这两个概念更多的是从现象层面描述了

异质性耐药的状态，严格意义上讲，机制层面可能与后续的相关因素有重叠

。鉴于相关文献在概念上的差异，我们此处偏重于它们的共性，并以此作为探讨

异质性耐药机制的起点。

如上所述，A型

和B型

的耐药性存在差异，而在患者体内可同时观察到这两种不同形态的

。A型

的形成可能会影响其根除治疗效果，造成反复感染

。研究发现，阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑均可诱导A型

的形成，其中阿莫西林的诱导能力最强

。

长期感染可能导致细菌基因组不稳定而产生突变

。由于

修复DNA的效率较低，在有抗生素时，DNA的损伤不能完全修复，改变的基因保留在其基因组中，使

基因组多样化，影响

的表型

。一些常见的

耐药基因的突变可能引起异质性耐药，如：RdxA基因的突变可能与

对甲硝唑异质性耐药有关

。GyrA和GyrB的突变与

对左氧氟沙星异质性耐药相关

。De Francesco等

研究发现,在体外A2143G点突变可能与

对克拉霉素异质性耐药有关。

对于

而言，异质性耐药既可以是患者体内某一部位同时存在对某种抗生素敏感和耐药的菌株，也可以是胃的不同部位(如胃窦和胃体)具有不同抗生素耐药性(敏感、耐药或混合)的菌株

，一些学者将后者称为内部异质性耐药(interniche heteroresistance)

。

异质性耐药形成的机制并不清楚，目前认为其可能的形成原因有以下几个方面。

同时，

具有丢失和获得外源DNA的能力，可通过转化实现基因重组

，这些发生在不同

菌株之间的基因重组事件，可导致宿主体内产生多种

菌株

。此外，Kao等

研究发现，转座酶介导的重组也参与了

基因组多样性的形成。基因组多样性可能导致异质性耐药

。

能够侵入胃上皮细胞和免疫细胞，该过程称为

内化(internalization)，内化可能是

逃避机体免疫系统和对抗生素耐药的一种方式

。有研究发现，耐药菌株相比敏感菌株有着更高的内化活性，提示内化水平可能与

对抗生素耐药性的差异有关。内化程度的不同可能会造成

对抗生素的敏感性存在异质性，由于抗生素进入胃组织深处时，其浓度下降，内化的细菌会暴露于较低浓度的抗生素中，在这种非致死的抗生素浓度下，内化的

可能产生耐药突变

。

具有趋向胃内pH值更高部位的特性，故

常定植于胃窦。长期单独使用PPI会使胃体产酸受到抑制，可导致

从胃窦向胃体扩散

。Selgrad等

发现，患者的胃窦和胃体

分离菌株之间具有不一致的药敏结果，经DNA指纹分析显示两者的指纹图谱相似甚至相同，该研究认为患者胃内不同部位

的异质性耐药不是由混合感染所致，而是由同一菌株变异、扩散形成。Farzi等

也认为胃体定植的菌株通常是从最初定植胃窦的菌株转移而来。

根据设计要求，选用斜齿圆柱齿轮作为减速箱的传动齿轮，这是因为与直齿圆柱齿轮相比，在相同条件下斜齿齿轮的尺寸更小。表1所示为选用的斜齿齿轮的相关参数，设计中采用7级精度，初定螺旋角β=14°。

胃窦和胃体

之间具有不同的抗生素敏感性已是一种常见现象

。如上所述，这种情况也被称为内部异质性耐药

。一些研究表明此类异质性耐药很可能是导致

治疗失败的原因之一

。此时，若只检测某一部位的药敏情况，极有可能造成漏诊

。因此，理论上讲，多部位内镜取样进行

药敏试验对于指导其治疗是有必要的

。

持久性细胞是指在抗生素治疗下无法生长但可以存活的细胞表现形式，当撤去抗生素后，此类细胞会恢复生长

。Andersson等

认为耐受抗生素的持久性细胞是群体异质性的一种特殊情况。也有学者认为持久性形成是细菌单克隆异质性耐药的潜在机制

。由于持久性细胞特性，其存在可造成治疗后细菌感染的复发

。

一些研究指出，来自意大利

和马来西亚

的

异质性耐药患者胃内不同分离菌株之间的DNA模式存在差异，提示异质性耐药可能是由于不同

菌株感染所致。

综上所述，在高校篮球运动发展的过程当中，如何解决当前存在的问题，是推动高校体育教师培养学生篮球运动发展最根本性的内容。因此，切实的从高校体育教师培养学生篮球运动的发展角度出发，对现存的问题进行解决，具有发展性的意义。

异质性耐药形成的原因有可能是基因改变，而非感染不同

菌株

。Kao等

通过分析我国台湾地区患者体内

遗传多样性发现，19例

异质性耐药患者中，仅有1例患者体内不同

分离菌株之间的DNA指纹模式差异较大，其余18例异质性耐药患者不同

分离菌株有相同或相似的DNA指纹模式，这提示异质性耐药可能是由于原有菌株基因改变产生，而非感染不同的

菌株所致。Selgrad等(德国)

、Lee等(韩国)

也有相似的研究报道。

选取2016年9月～2018年7月本院接诊的冠心病患者50例作为实验组，男28例，女22例，年龄41～67岁，平均（50.21±3.69）岁，不稳定型心绞痛者21例，稳定型心绞痛者18例，心肌梗死者11例。另选取本院同期接诊的健康体检者30例作为对照组，男16名，女14名，年龄38～67岁，平均（49.83±4.01）岁。所有入选者对此研究均知情同意，依从性良好，能够积极配合完成检验，且有完善的临床资料，获得医学伦理委员会批准。比较两组的性别构成比等一般资料，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 H.pylori异质性耐药的诊断

拓展阶段分为两部分：小组讲台汇报和教师引导讨论。十个小组依据抽签书序，选取代表上台汇报叙述性描写特征（每组2分钟）（组内一位同学在黑板书写句子），汇报后同学和老师给予评价反馈（每组1分钟）。所有组汇报结束后，教师引导讨论给出一个综合性的概括，然后结合文章和同学一起逐一详细找出和解释叙述性描写的应用（共25分钟）。最后的5分钟为整个讲解及授课的综合答疑和布置作业。

忽视

的异质性耐药可能会低估其耐药的程度，影响根治效果，若能检测出

异质性耐药，则可能对

的根除具有重要意义

。但关于

异质性耐药的检测并不理想，一方面，目前检测

耐药常用的方法仍是细菌培养后进行药敏试验

。而获得

主要通过内镜检查，由于其侵入性和患者依从性差等原因，许多未进行内镜检查的患者无法进行药敏试验

。另一方面，胃内不同部位

之间呈现不同的抗生素敏感性已较为常见

，如果仅从胃窦或胃体检测其耐药性，也可能会低估

的耐药程度，影响治疗效果

。因此，理论上来讲，除了检测同一部位细菌亚群耐药情况之外，检测不同部位

的耐药情况也是有必要的，这样不仅可以增加检测出

的可能性，同时也提高了检出异质性耐药的可能性

。截至现在，国内外并无标准的检测

异质性耐药的方法，目前报道与

异质性药敏检测相关的方法如下。

异质性耐药的常用表型耐药检测方法有纸片扩散法、E-test、PAP等。PAP被认为是确定异质性耐药的金标准，其是在梯度抗生素浓度为增量的数个平板/液体培养基中对细菌生长进行计数，以完全抑制细菌生长的抗生素浓度与开始抑制细菌生长的抗生素浓度之间的差值来描述细菌异质性耐药情况

。但若每例患者均进行典型的PAP方法，会耗费大量时间精力，不适用于临床的快速检测

。因此，El-Halfawy等

推荐将纸片扩散法或E-test与PAP结合以提高检测效率，方法为：首先进行纸片扩散法或E-test，若在抑菌区内无细菌生长，则认为是均质性耐药。若发现有生长的菌株，则初步判定异质性耐药，进一步通过PAP验证，若完全抑制细菌生长的抗生素浓度与开始抑制细菌生长的抗生素浓度之间相差>8倍，则认为是异质性耐药，若相差值=8倍，则称为中间异质性耐药(intermediate heterogeneity)，若≤4倍，则认为是均质性耐药，但该研究推荐的检测方法未阐述差值在4～8倍时所表示的耐药情况。

分子检测具有快速、无需细菌培养等优点，但需要明确耐药位点，目前仅适用于

对克拉霉素和喹诺酮类抗生素的药敏检测

。检测异质性耐药的主要方法是基于PCR，PCR在检测异质性耐药方面有一定的优势，但也存在特异性低或假阴性的情况

。目前报道有关

异质性耐药的分子检测方法如下。

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区域上出露地层有青白口系、震旦系、寒武系、白垩系和第四系。其中冷家溪群大面积出露于幕阜山复式岩体西南部, 属于扬子陆块变质褶皱基底，为一套浅变质碎屑岩系[3]。

3.2.1 随机扩增多态性DNA标记-PCR(random amplified polymorphic DNA markers-PCR, RAPD-PCR)：RAPD-PCR被认为是鉴别

分离株的一种简单、快速、低成本的理想方法

。该方法能够区分不同菌株之间的异质性耐药

。但这种方法不能提供有关其毒力特性和遗传进化的信息

。

3.2.2 ddPCR：Sun等

发现，ddPCR是一种较为灵敏的检测方法，可用于检测

对克拉霉素耐药的异质性，而且具有无创的特点。该方法可以同时对胃黏膜标本和粪便标本进行检测，且该报道显示其对两种标本

感染的检出率均接近

C尿素呼气试验。

4 总结与展望

综上所述，

的异质性耐药现象其实并不少见

。虽然一些研究表明异质性耐药的存在可能对临床根除

的影响有限

。但随着对

异质性耐药研究的深入，不少研究提示忽视异质性耐药可能会影响

的根除效果，应给予重视

。但到目前为止，仍然缺少

异质性耐药的标准定义和检测方法，这限制了

异质性耐药的进一步研究

。同时，由于

异质性耐药与根除治疗失败相关的临床证据仍然缺乏，导致临床对于异质性耐药的重视程度依旧不足

。因此，有必要进行大样本的临床研究，全面系统地探究

对常用抗生素异质性耐药的发生率及对根除治疗的影响。此外，类球体形态可能是

的一种持久形式，其对根除治疗的负面影响需进一步探究

。

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