Hi-C技术：探究三维基因组迷宫

■文/田晓雪

H i-C 技术自2009年由美国马萨诸塞大学医学院教授乔布·德克尔（Job Dekker）研究团队首次提出以来，发展得如火如荼。这把揭秘三维基因组的钥匙将会在哪些方面助力科研、造福人类呢？

众所周知，一颗受精卵经过不断增殖、分化，可以生长发育为一个由种类高达200 余种、数目以万亿计的细胞组成的复杂机体。然而，共享一套遗传系统的细胞是如何发育成为形态、功能各异的组织器官的呢？作为主要的遗传物质，脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）的展开长度可以达到2 米，这些DNA 是如何被放置在一个直径只有10 微米左右的细胞核中的呢？在这种极度压缩的环境下，它们又是如何精确调控细胞功能，维持机体稳态的呢？

长期以来，这些难题像一把“枷锁”，严重阻碍了生命科学的发展进程。高通量染色质构象捕获（High-throughput/resolution chromosome conformation capture，Hi-C）技术的出现，帮助我们深入探究基因组三维结构之谜，为基因研究提供了强大的推动力，是一把名副其实的基因钥匙。

以我们自身为例，人类体细胞的核内存在着彼此独立又相互联系的46 条染色体，它们主要由遗传物质DNA 和组蛋白组成。其中，DNA 一般以染色质丝的形式存在，染色质丝缠绕在组蛋白复合物上，形成串珠样结构。串珠样的染色质会进一步像电话线一样缠绕折叠，形成极度压缩而又高度有序的状态，分布在细胞核的特定位置，称为染色质疆域（Chromosome territories，CT）。简单来讲，染色质疆域指的是不同染色体占据的不同空间。一直以来，我们主要通过X 射线、显微镜等传统方式观察染色质和其折叠状态。受限于分辨率低、通量小等因素，我们对其折叠的具体机制知之甚少。作为基因组密钥，Hi-C 技术的出现为我们提供了新的视角。

Hi-C 技术的原理

Hi-C 技术源于染色体构象捕获（Chromosome conformation capture，3C）技术，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息分析方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA 在空间位置上的关系，通过对染色质内全部DNA 相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构。实验流程并不复杂，主要包括细胞交联（Crosslink）、酶切（Digestion）、环化连接（Ligation）、纯化建库（Purification and Library preparation）和测序分析（Sequencing）等步骤(见图1)。

Hi-C 技术揭秘染色质空间结构

图1 Hi-C 实验流程

染色质疆域是我们对染色质空间结构认知的第一步，Hi-C 技术不仅可以高分辨地解析出传统方法观察不到的染色质疆域，而且能进一步帮助我们解析出染色质疆域内各种亚结构。如图2 所示，按照基因组从大到小的顺序排列，依次为A/B 染色质区室（A/B compartments）、域（domain）和染色质环（Chromatin loop，CL）。具体来讲，放大染色质疆域的某一空间，我们可以根据染色质的活性将其分为A/B 区室。A 区染色质为活跃区，基因表达较为丰富，鸟嘌呤和胞嘧啶（GC）含量较高，通常高度转录，包含用于主动转录的组蛋白标记，位于细胞核的内部；B 区是关闭的染色质，结构紧凑，基因表达丰度和转录活性均较低，含有基因沉默的组蛋白标志物，位于核的外围。在A/B 区室中，我们将比例尺进一步放大，可以发现互相作用相对频繁的基因组区域，这些就是域，如拓扑相关结构域（Topologically associated domain，TAD） 等。TAD 是一个高度自关联的连续区域，通过明显的边界与相邻区域分离开来。TAD 边界通常具有大量的绝缘子蛋白和黏连蛋白，对结构的维持及稳定性具有重要作用。TAD 是一个独立的调控单元，在哺乳动物基因组中，TAD 通常由转录抑制因子CTCF 分割开来。CTCF 非常活跃，它可以和黏连蛋白复合物结合，把分布较远的增强子（enhancer）和启动子（promoter）等DNA 元件绑到一起，形成染色质环，作为染色质三维结构的基本结构。利用Hi-C 技术，我们可以从A/B 区室、TAD 和染色质环三个层次解析基因组的三维结构，更好地理解机体内正在发生的生理生化过程。

科学家利用Hi-C 技术以机体发育和衰老等生理过程为模型，增进了对染色质层级结构的发生机制及其与基因组功能关系的理解。其中，染色质环可以使空间上相隔较远的DNA 调控元件，如启动子和增强子等在物理维度上相互接近，从而调控基因转录、核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）剪接等重要的生化过程。TAD 作为更大、更保守的结构功能单元，通过限制、引导和促进增强子-启动子的相互作用，从而协调基因调控。此外，科学家还发现：在机体发育早期，TAD 和A/B 区室等染色质高级结构存在着缓慢建立的过程；在配子发生、合子基因组激活及组织分化发育等一系列事件中，包括TAD、A/B 区室等在内的基因组三维结构会经历剧烈且特异性的消失-重建过程。

图2 基于3C 技术的三维基因组的层次结构

Hi-C 技术助力疾病研究

基因组三维结构异常与表观遗传修饰如DNA修饰、组蛋白修饰等密切相关，在疾病的发生、发展中发挥着重要作用。Hi-C 技术帮助我们深刻认识到，许多疾病的发生、发展与基因组三维结构的异常存在相关性。当基因组结构发生变异，如单核苷酸突变、小片段核酸序列（50 个碱基对以下）的异常插入或缺失（Insertion-deletion，InDel）和染色体结构变异均可导致疾病的发生、发展。例如，染色质环的重要组成部分黏连蛋白发生突变时，会引起基因组的结构异常，导致Cornelia de lange 综合征（CdLS）等遗传病的发生。WNT6/IHH/EPHA4/PAX3 等基因位点TAD 区域遭到破坏时，会引起异常的增强子-启动子相互作用，从而使基因错误表达，导致先天性发育障碍。

基因组三维结构与病毒感染密切相关。科学家应用Hi-C 技术发现休眠状态下的乙型肝炎病毒（HBV）主要寄宿在19 号染色体的异染色质附近区域，但当其活化后，则会更多地寄宿在基因组转录活跃区域。同样的，对罕见的艾滋病自愈者进行Hi-C 数据分析发现，艾滋病病毒（HIV）主要存在于19 号染色体的中心粒卫星DNA 或KRAB-ZNF 基因位置，且多异染色体标记，与基因转录起始位置或开放染色质相距较远。

另外，基因组三维结构在肿瘤发生、发展中也发挥着重要作用。绝缘子蛋白CTCF 的旁系同源蛋白CTCFL 在多种肿瘤中表达异常，可维持肿瘤干细胞的活性，提高肿瘤风险等级，而且严重影响肿瘤药物的治疗作用。Hi-C 技术与其他组学技术的联合开发应用，为我们理解肿瘤的发生、发展提供了新的视角。科学家应用Hi-C 技术和多组学技术发现：相比正常细胞，乳腺癌细胞中约12%的基因组区域发生了A/B 区室的转换；前列腺癌细胞比正常细胞具有更多的TAD 和更小的TAD 长度，并且在具有拷贝数变异的区域里发现了许多癌症特异性的TAD 边界；在转移性胰腺癌细胞中，A/B 区室、TAD 和染色质环都发生了显著变化；在多发性骨髓瘤中，拷贝数变异的断点常与TAD 边界重合；对脊索瘤进行Hi-C、RNA 高通量测序（RNA-seq）等多组学分析发现，碳酸酐酶2（Carbonic anhydrase II，CA2）在脊索瘤中高表达，可以作为新的治疗靶点。由此可见，Hi-C 技术在疾病的诊断和治疗方面发挥着独特作用。

Hi-C 技术推动构建物种进化树

此外，Hi-C 技术在基因组从头拼接、物种进化树构建方面也发挥了巨大作用。目前，高通量测序方法只能够将基因组组装到重叠群/脚手架（Contig/Scaffold）水平，无法获得染色体水平的基因组信息。Hi-C 辅助组装技术可将Contig/Scaffold 挂载到不同的染色体上，提升基因组质量。真核生物间Hi-C 图谱的比较使我们对物种间差异有了进一步的认识，并有助于揭示物种进化和选择的奥秘。

随着Hi-C 衍生技术的开发应用，我们对细胞内的微观世界有了更深入的了解和认识。然而，我们还应该认识到，Hi-C 技术依然存在诸多局限性：分辨率较低、与高分辨率显微镜结果拟合度较低、实验门槛较高和数据分析难度较大等。但是，我们坚信，随着技术的更新迭代和多种组学技术的联合开发应用，我们将会慢慢揭开三维基因组的奥秘，助力疾病研究，为人类福祉作出贡献。