孕早期稽留流产绒毛细胞遗传学分析

孙诗雨，陈小丽，王晓娅，刘彩玉，蓝信强

1.青岛大学附属威海市立第二医院/山东省威海市妇幼保健院医学遗传科，山东威海 264200；2.广东省东莞市宜安科技股份有限公司，广东东莞 523662

孕早期流产是妇产科常见的一种疾病，也是女性在孕早期容易出现的并发症之一。孕早期流产包括了自然流产和稽留流产两大类，其中稽留流产是指胚胎已死亡但滞留在宫腔内未及时排出的一种流产疾病，也是孕早期流产中一种较特殊的流产类型[1]。医学研究表明，造成孕早期流产的原因包括遗传因素，细菌和病毒引起的宫内感染，内分泌异常，免疫因素等[2]。其中遗传因素被认为是最常见的诱发孕妇孕早期流产的因素，其致病机制主要包括染色体数目异常和染色体结构异常[3-4]。因此，本研究拟对本院孕早期稽留流产绒毛染色体检测结果作回顾性分析，为临床上研究遗传因素对孕早期稽留流产的影响提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月至2021年6月于本院行清宫术和绒毛染色体检查的166例孕早期稽留流产孕妇为研究对象，年龄22～47岁，平均年龄31.09岁；B超提示孕妇胚胎停止发育。本研究经本院医学伦理委员会批准，孕妇均已知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本和绒毛培养 采用B超定位经宫颈绒毛吸取法获得其绒毛标本，将生理盐水中的绒毛组织去除血凝块和其他非绒毛组织，采用灭菌的眼科剪将绒毛剪碎，加入0.25%的胰酶消化。加入1 mL培养基终止消化，以1 500 r/min离心10 min，去除上清液。加入培养基混匀后置于37 ℃，含5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2绒毛细胞培养和染色体制备 细胞培养5～7 d后，于倒置显微镜下观察细胞状态并进行换液。待细胞生长状态适中时加入秋水仙素，阻断细胞周期于中期，继续培养4 h后收集细胞，并制备染色体玻片。利用G显带法对玻片进行显带，使用Leica染色体分析系统拍照保存。计数至少20个分裂象，分析5个细胞核型。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0软件对数据进行处理和分析。计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1绒毛细胞培养结果 在166例孕妇的流产绒毛中，细胞培养成功159例，占总例数的95.78%。细胞培养失败7例，其中5例细胞培养存在污染，2例细胞无法培养贴壁。

2.2绒毛染色体核型分析结果 在159例成功进行绒毛染色体核型分析的孕妇中，核型正常有54例，核型异常有105例，其中包括染色体数目异常98例，占异常核型的93.33%。染色体数目异常中，单体45,X核型异常有6例、三体核型异常有63例。三体核型异常中16-三体有18例、22-三体有12例、7-三体有6例、15-三体有5例、21-三体有4例、2-三体有3例；复合三体有3例，包括48,XX,+5,+9、48,XX,+7,+8、48,XY,+20,+21；三倍体有16例，其中69,XXX有4例、69,XXY有8例、69,XYY有1例、70,XXXY有1例、70,XXY,+21有1例、71,XXXX,-11有1例；四倍体有5例，其中92,XXXX有3例、92,XXYY有1例、90,XXYY,-13,-13有1例；嵌合体有3例，分别是45,X/46,XX、46,XX/46,XY和47,XX,+16/94,XXXX,+16,+16。此外，染色体结构异常有7例。见表1。

表1 绒毛染色体核型分析结果

2.3绒毛染色体异常核型与孕妇年龄的关系 结果发现30～34岁的孕妇异常核型占比为71.11%；35～39岁的孕妇异常核型占比为70.94%；40～47岁的孕妇异常核型占比为63.64%；22～24岁的孕妇异常核型占比最低，为50.00%。30～47岁的孕妇异常核型占比为70.11%，与正常核型占比比较(29.89%)，差异有统计学意义(P<0.05)；22～29岁的孕妇异常核型占比为61.11%，与正常核型占比比较(38.89%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 绒毛染色体核型与孕妇年龄的关系

2.4绒毛染色体核型与流产胚胎性别的关系 159例成功进行绒毛染色体核型分析的孕妇中，男胎75例，其中异常核型胚胎52例，异常核型占比为69.33%；女胎84例，其中异常核型胚胎53例，异常核型占比为63.10%。见表3。

表3 绒毛染色体核型与流产胚胎性别的关系

2.5不同孕产史孕妇绒毛染色体状况 159例成功进行绒毛染色体核型分析的孕妇中，生育过健康孩子的孕妇24例，其中绒毛染色体异常核型10例，绒毛染色体正常核型14例；未生育过健康孩子的孕妇135例，其中绒毛染色体异常核型95例，绒毛染色体正常核型40例。见表4。

表4 不同孕产史孕妇绒毛染色体状况

3 讨 论

研究表明女性在妊娠期间发生流产的概率约为15%，流产不仅会给孕妇带来身体损伤，还会给孕妇及其家属造成精神上的伤害[5]。在所有导致孕妇出现稽留流产的原因中，胚胎染色体异常是最主要的原因[5-6]。因此，对胚胎染色体异常情况进行分析和研究，对帮助有流产史的育龄期女性成功妊娠具有重要意义。本研究对166例稽留流产孕妇采用B超定位经宫颈绒毛吸取法获得其绒毛标本，进行流产绒毛染色体检查，采用绒毛细胞培养法进行绒毛染色体培养和制备，其中培养成功159例，培养成功率为95.78%。

本研究培养成功的159例绒毛细胞标本中，染色体异常占66.04%，其中染色体数目异常占异常核型的93.33%。本研究表明染色体数目异常是导致孕早期稽留流产的主要原因。然而，染色体数目异常形成的主要原因是由于配子形成时或受精卵卵裂时出现染色体不分离，从而导致染色体的单体、三体、复合三体、三倍体及四倍体的产生[7-11]。关于非整倍体异常的产生机制，主要是由染色体的减数分裂时期，染色体不分离或染色体缺失导致[12]。本研究发现16-三体、69,XXX/XXY/XYY、22-三体、7-三体、45,X、15-三体、21-三体占主要异常核型，其中16-三体和22-三体是孕早期稽留流产常见的三体核型。已有研究报道，16-三体是稽留流产绒毛细胞中常见的染色体核型[13]，然而关于16号染色体高度致死的原因是否与其着丝粒的位置相关需要进一步研究证实[14]。对于多倍体染色体核型形成的原因，主要是由于双雌受精和双雄受精[15]。然而，绒毛分析结果为多倍体核型的胎儿父母，进行外周血染色体检查结果大多正常[15]。

本研究发现不同年龄段孕妇绒毛染色体结果存在明显差异。30～47岁的孕妇，其绒毛染色体核型异常的发生率明显高于22～29岁的孕妇。其中30～34岁的孕妇异常核型占比为71.11%，35～39岁的孕妇异常核型占比为70.97%，40～47岁的孕妇异常核型占比为63.64%，然而，22～24岁的孕妇异常核型占比仅为50.00%。同时，30～47岁的孕妇异常核型占比(70.11%)与正常核型占比(29.89%)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明胚胎染色体异常的占比随着女性年龄增长而逐渐增加。这是因为随着女性生育年龄的逐渐增长，生殖系统会逐渐老化，卵巢周围的微环境改变，以及卵母细胞凋亡速度增加，导致卵细胞发生异常，从而导致形成非整倍体的卵细胞概率增加[16-18]。因此，建议高龄孕妇进行羊水细胞产前诊断检测，对降低新生儿的出生缺陷比例具有重要的意义。

关于孕妇稽留流产的研究，除了与绒毛细胞染色体异常和孕妇年龄有关外，是否与胎儿性别存在关系需要进行深入探讨。本研究发现，159例成功进行绒毛染色体核型分析的孕妇中，女胎84例，占稽留流产胎儿的52.83%，其中女胎正常核型占比为36.90%，高于男胎正常核型的占比(30.67%)。然而在异常核型中，男胎占比为69.33%，较高于女胎的63.10%。此外，绒毛细胞三倍体核型的研究发现，69,XXY是三倍体的主要核型。因此，关于胎儿性别与稽留流产的倾向性，以及与绒毛细胞核型的相关性尚无明显结论，还需要长期的研究证实[9,19]。

本研究中，按照孕妇孕产史，将孕妇分成生育过健康孩子的孕妇和未生育过健康孩子的孕妇，结果发现已生育过健康孩子的孕妇，其绒毛染色体正常核型占比为58.33%。然而，未生育过健康孩子的孕妇(包括有复发性流产、死胎及怀畸形胎儿等异常孕产史)，绒毛染色体异常核型占比为70.37%。该结果进一步表明，对于多年未避孕或有不良孕产史等原因而未生育过健康孩子的部分孕妇，其流产原因可能与胎儿染色体核型异常相关。

综上所述，绒毛染色体核型异常是导致孕早期稽留流产的主要原因，且染色体异常核型主要为染色体数目异常，其中常染色体三体核型最为常见。此外，染色体畸变与孕妇年龄等有关，因此，高龄孕妇孕期行羊水穿刺产前诊断检查尤为重要[20]。通过对孕早期稽留流产绒毛染色体的核型进行分析，可为孕妇再次妊娠，以及为育龄期女性的优生优育提供重要的理论依据。