聚苯乙烯微球的表面等离子体共振图像处理与分析

吴静宁，刘紫威，杨 博，蔡 宸，祁志美，3*

（1.中国科学院 空天信息创新研究院 传感技术国家重点实验室，北京 100190；2.中国科学院大学 电子电气与通信工程学院，北京 100049；3.中国科学院大学 光电学院，北京 100049）

1 引 言

表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）传感器因其免标记、非侵入性、高灵敏度和原位检测的特点而被广泛应用于生化分析中，主要采用被称为Krestchmann结构的SPR棱镜激发结构［1］。根据光学传感信号的不同，SPR传感器可分为强度型/角度型、相位型、偏振干涉型和波长型。20世纪80年代后，表面等离子体共振成像（Surface plasmon resonance imaging，SPRi）［2］和表面等离子体显微镜（Surface plasmon microscopy，SPM）［3］被相继提出并得到蓬勃发展。1999年，Giebel小组用棱镜激发结构的表面等离子体共振显微镜（Surface plasmon resonance microscopy，SPRM）在不同的入射角度对金鱼胶质活细胞进行了成像，并对细胞/基质的距离进行了量化［4］。细胞膜与基质之间的黏附情况得以以高对比度可视化，垂直分辨率在纳米范围内。但由于表面等离子体（Surface plasmas，SPs）的传播和斜入射造成的像差，横向分辨率表现不佳。通过优化棱镜形状和扫描成像方式可以减小像差［5］。除了像差问题外，棱镜激发结构的角度扫描型SPRM还有其他固有缺点。当改变入射角度时，SPR芯片上的照明区域会发生变化，这个问题可以通过增加一对固定的反射镜和角度可控的反射镜来解决［6］。此外，对于常规显微系统，高倍物镜的工作距离更短，即要求物镜更靠近样品表面，而棱镜的尺寸限制了物镜与样品之间的距离，由此也限制了棱镜型SPRM的分辨率。1998年，H.Kano等人提出使用高数值孔径显微物镜激发SPR［7］，这种新型结构的SPRM从2000年开始迅速发展［8-9］。通过增加信号接收方向来弥补SPs传播带来的图像模糊［10-12］，高数值孔径物镜型SPRM的空间分辨率可接近衍射极限，在单细胞、单病毒［13］、单纳米粒子［14］、单分子［15-16］等成像检测方面展现出极大潜力。但由于高数值孔径物镜中存在偏振相关衰减和光学相差，菲涅尔模型不再适用于物镜型SPRM，使得其中SPR的变化难以被定量解释，需要进行复杂的参数矫正［17］，物镜型SPRM的量化分析方法还有待进一步的研究。

聚苯乙烯微球合成成本低、粒径小、疏水性强、分散性好，还具有相对稳定的物理化学性质，在分析化学、生物医学、标准计量领域中应用广泛，在表面成像检测研究中也发挥出重要的尺度比对与表征作用［13-14，16-19］。本文使用一种新 型的高光谱表面等离子体共振显微镜（Hyperspectral surface plasmon resonance microscopy，HS-SPRM）对聚苯乙烯微球进行成像，它将波长检测型的棱镜SPRM与高光谱成像系统相结合。不同于角度扫描型SPRM，波长检测型SPRM不需要频繁改变入射角度，而是从光谱中提取与消逝场内介质等效折射率密切相关的共振信息。高光谱成像系统可以提供样品图像中每个像素点的光谱，这使得HS-SPRM具备在二维空间内像素级的光谱分析能力。使用基于不同偏振的光谱校正方法对聚苯乙烯微球的高光谱数据进行图像优化，对比SPR成像结果与反射式明场显微镜图像，发现二者存在明显差异。

2 实 验

2.1 实验样品

金膜SPR传感芯片制备：玻璃基片依次用丙酮、乙醇、去离子水超声、清洗后烘干，然后在洁净的玻璃基片上依次溅射3 nm铬和40 nm金。

聚苯乙烯微球样品片制备：购置的聚苯乙烯微球（直径9.0～9.9 μm，质量浓度5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用去离子水稀释后滴加在金膜SPR传感芯片表面，静置至液体自然风干。

2.2 实验装置

反射式明场显微图像采集自蔡司金相显微镜（Axio Imager A2m）。SPR高光谱数据采集自实验室自研的HS-SPRM装置，其结构示意图如图1所示。宽带白光经多模光纤接入准直器中，得到较为准直的平行光束。平行光束经过偏振片和孔径光阑进入基于Kretschmann结构的棱镜型SPR激发结构，带有检测样品的SPR传感芯片通过折射率匹配液与45°/45°/90°玻璃棱镜耦合，反射光通过凸透镜进行成像，这里称为一级成像。推扫式高光谱成像仪（GaiaField Pro-V10E，四川双利合谱公司）通过镜筒与物镜组合成高光谱显微成像光路，垂直放置。调节平面反射镜的位置与角度，可使一级成像光进入高光谱显微成像装置中。保证物镜的工作距离恰好位于一级成像透镜的像平面上，就能获得对焦清晰的样品SPR图像。

图1 高光谱SPR显微成像系统装置示意图。LS：激光泵浦宽带光源；MF：多模光纤；CD：准直器；LP：线性偏振片；AD：孔径光阑；L：f=30 mm双胶合消色差透镜；M：平面反射镜；IP：L的像平面；OBJ：物镜；HSI：推扫型高光谱成像装置。Fig.1 Schematic diagram of HS-SPRM system（LS：laser-pumped broadband light source；MF：multimode optical fiber；CD：collimating device；LP：linear polarizer；AD：aperture diaphragm；L：f=30 mm achromatic cemented-double lens；M：mirror；IP：the image plane of L；OBJ：objective lens；HSI：hyperspectral imaging device）.

准直器、偏振片和孔径光阑是固定在同一个带有刻度的旋转台上，可通过调节旋转台调整并读取入射角度（入射光与棱镜直角面法线的夹角）。棱镜可以水平移动，因此可以调整入射光照射在样品上的光斑位置。一级成像透镜的倾斜角度可调节，并且倾斜角度应与偏振片和光阑关于棱镜中轴线镜像对称。平面反射镜的位置和倾斜角度可调节，是主要的光路对准和调焦部件。后续的高光谱显微成像部分为一个整体，可在一定范围内水平、垂直整体平移。

2.3 实验方法

将带有聚苯乙烯微球样品的金膜SPR传感芯片通过折射率匹配液与棱镜耦合，打开光源，调节旋转台使得平行光以0°入射到棱镜直角边，此时可以获得最小的像差［5］。调节偏振片的角度，分别采集0°偏振（Transverse electric，TE模式）和90°偏振（Transverse magnetic，TM模式）下聚苯乙烯微球的高光谱SPR图像。

2.4 数据处理

高光谱成像仪采集并保存的高光谱数据是以.raw格式存储的二维数组，可从中解析出单波段的二维图像信息，或是单像素点的光谱曲线。实验室用自主开发的基于Python语言的高光谱数据解析软件对高光谱SPR数据进行进一步处理。将同一入射角度下的TM模式和TE模式的高光谱图像视为一组数据，分别用HSITM和HSITE表示。数据处理过程具体分为以下3步：

（1）自动识别感兴趣区域，去除背景数据。高光谱成像仪的CCD光电接收器的尺寸是1 392 pixel×1 040 pixel，在前序光路中调整前级成像透镜与平面镜角度与位置时，可能使得最终CCD接收到的光斑尺寸与位置发生偏差。图2原始的TM与TE偏振SPR高光谱数据中，无用的黑背景占据了大部分区域，如果将背景数据也代入后续计算，是无用且耗费大量计算资源的，因此需要先对感兴趣区域（Region of interest，ROI）进行分割提取，即提取出高光谱显微镜视野范围。利用显微图像光斑皆为圆形的特点，先取单波段灰度图像进行阈值处理识别光斑轮廓，然后根据圆形轮廓计算光斑的圆心与半径，最后生成圆形掩模版用于截取高光谱数据。为了提高自动识别圆形轮廓的准确性，这里选择一系列信噪比较高的单波段图像的轮廓识别结果进行平均。最终将截取后的感兴趣区域的高光谱数据转存为三维数组。

图2 SPR高光谱数据立方体处理方法与流程示意图Fig.2 Schematic diagram of the SPR hyperspectral data cube processing method and procedure

（2）在图像层面进行光谱校正。在光谱维度上分别对HSITM、HSITE进行数据切片，得到波长范围在400～1 000 nm间360个单波段灰度图像，将TM模式下的单波段图像InTM与TE模式下的单波段图像InTE相比之后进行归一化操作，表达式如式（1）、（2）所示：

其 中n为整 数 且n∈[1，360]。由此 得 到360张TM/TE模式下的单波段归一化图像，再将这些单波段图像拼接成数据立方体HSITM/TE。

（3）在光谱层面进行图像平滑。在空间维度上对HSITM/TE进行分割，提取每个像素点的光谱，进行多项式平滑滤波，去除光谱噪声。最终得到光谱校正的平滑的高光谱数据。

仅TM偏振光可激发SPR现象，故TE模式数据中的光谱即为经过棱镜全反射的光源光谱。因此数据处理得到的TM/TE模式下的光谱曲线可视为消除了光源光谱影响的校正曲线，SPR共振峰的位置更加显而易见。此外，在整套光路系统中可能存在难以清除的尘埃或是光学器件瑕疵，在高光谱成像结果中形成固有污点，使用上述数据处理的方法可以大幅降低固有污点的对比度，削弱固有污点对SPR图像分析的影响。

3 结果与讨论

3.1 聚苯乙烯微球SPR图像处理效果

图3（a）、（b）分别为TM偏振与TE偏振的原始高光谱伪彩色图像，仅在发生SPR的TM偏振图像中隐约可见聚苯乙烯微球的轮廓。图3中“P1”所指的是一个聚苯乙烯微球样品所在的位置，“P2”指向无样品的位置。图3（e）、（f）分别为TM偏振与TE偏振图像中箭头指向的单像素点的原始光谱。TM偏振中的聚苯乙烯微球与空气介质的SPR共振光谱存在明显区别，故而在高光谱伪彩色图像中体现出可区分微粒轮廓的色彩差异。TE偏振不发生SPR，故两个位置点的光谱一致，均为经棱镜全反射的光源光谱。

光学系统中的固有污点在成像结果中呈现为未聚焦的黑色衍射光斑，极大地影响了SPR图像中对微粒样品位置与轮廓的判断与分析。这些固有污点存在于成像系统中，不会随样品或光源偏振的改变而改变，但位置与尺寸会因装置放大倍数以及棱镜出射光方向产生细微差别。采用前述的数据处理方法第二步后得到TM/TE模式下的SPR图像，如图3（c）所示，可见固有污点的对比度被大幅降低，微粒样品的轮廓得以凸显，但光谱中的随机噪声也被增强。校正后的光谱不再具有光源光谱本身的特征，如图3（g）所示，由此避免了光源光谱对SPR共振信息提取造成影响。进一步对TM/TE模式下的SPR高光谱数据进行光谱平滑，得到的结果如图3（d）、（h）所示，图像与光谱曲线中的随机噪声得以削弱，更有利于SPR共振峰信息的精确提取。

图3 聚苯乙烯微球的SPR图像处理效果。（a）未经处理的SPR高光谱伪彩色图像；（b）未经处理的TE偏振高光谱伪彩色图像；（c）按照TM/TE模式处理后的SPR高光谱伪彩色图像；（d）曲线平滑处理再按照TM/TE模式处理得到的SPR高光谱伪彩色图像；（e～h）分别为图3（a～d）中指示的单像素点对应的光谱曲线。Fig.3 SPR images processing effect of polystyrene microspheres.（a）Original SPR hyperspectral pseudocolor image；（b）Original TE-polarized hyperspectral pseudocolor image；（c）SPR hyperspectral pseudocolor image processed in TM/TE mode；（d）Smoothed TM/TE mode SPR hyperspectral pseudocolor image；（e～h）Single-pixel SPR spectra indicated in Fig.3（a～d）.

3.2 明场反射显微图像与SPR图像的对比与分析

图4展示了聚苯乙烯微球样品片上同区域的反射式明场显微镜成像结果与SPR成像结果，箭头指出的聚苯乙烯微球“ps1～ps8”在图4（d～f）中依次对应。对比明场反射图像与SPR图像发现二者主要存在以下几点差异：

图4 聚苯乙烯微球的反射明场显微图像与其SPR图像的对比。（a）反射式明场显微图像；（b，c）数据处理前与处理后的525 nm单波段SPR灰度图像；（d～f）为图4（a～c）中的放大框选区域。Fig.4 Comparison of the reflected bright-field microscopic image of a sample of polystyrene microspheres with the SPR image of the same sample.（a）Reflected bright-field microscopic image；（b，c）525 nm single-band SPR grayscale images before and after processing；（d～f）Magnified views of the selected areas in fig.4（a～c）.

（1）图像尺寸在水平方向（平行于SPs传播方向）上明显发生了形变；

（2）明场图像中聚苯乙烯微球的灰度较为均一，而SPR图像中各个微球的灰度值差别较大，如“ps2”与“ps4”的灰度明显浅于“ps3”；

（3）明场图像中可见的聚苯乙烯微球在SPR图像缺失了，如箭头“ps6”指向的位置；

（4）在明场图像中尺寸相差较大的微粒，如“ps7”和“ps8”，在SPR图像中尺寸相近。

分析以上成像差异的成因，差异（1）方向异性的图像形变是因为在棱镜型SPRM中光学响应不是球对称的［5］。差异（2）～（4）皆与消逝场的性质有关，SPR的变化是与消逝场内介质的折射率密切相关的，本文实验条件中消逝场内的介质可视为空气与聚苯乙烯构成的混合介质，聚苯乙烯微球与金膜表面距离的微小差距将影响混合介质的等效折射率，从而引起SPR条件的变化，因此各个聚苯乙烯微球与金膜表面距离的参差不等使得SPR图像中聚苯乙烯微球呈现非均一性的灰度。

对于差异（3），由于金膜表面激发的消逝场的穿透深度与入射光波长有关，通常只有几百纳米（入射光波长630 nm时，激发金膜表面的消逝场穿透深度为162 nm）［20］，当聚苯乙烯微球与金膜表面的距离超出消逝场的穿透深度时，如图5中“P2”所示的情况，此时等同于消逝场中的介质为空气，那么微球将从SPR图像的“视野”中消失。如图4（d）中“ps6”微球处于虚焦状态，明显与“ps5”与“ps7”不在同一平面高度上，可判断该微球远离金膜，且距离超出消逝场的穿透深度。

对于差异（4），图4中“ps1～ps7”微球粒径平均约10 μm，“ps8”粒径约3 μm，均远大于消逝场的穿透深度，将聚苯乙烯微球视为刚性球型，且与金膜表面的距离存在微小差异，“ps7”与“ps8”微球在消逝场探测深度中的投影面积就有可能是相近的，如图5中“P1”与“P3”所示的情况，由此明场反射显微镜中体积差别较大的微球在SPR图像中也可能呈现为尺寸相近的图形。

图5 用于分析聚苯乙烯微球的棱镜耦合SPRi传感器结构示意图Fig.5 Schematic diagram of the prism coupled SPRi sensor structure for analysis of polystyrene microspheres

4 结 论

本文使用高光谱表面等离子体共振显微镜对平均粒径10 μm的聚苯乙烯微球进行SPR成像，对基于TM与TE偏振条件的高光谱数据进行SPR图像处理，得到平滑后的TM/TE模式的SPR高光谱数据明显优于处理前的效果。在图像层面上，该数据处理方法显著削弱了图像中固有污点的对比度，从而凸显出样品的位置与轮廓；在光谱层面上，TM/TE模式光谱消除了光源光谱的影响，且平滑后弱化了随机噪声，使得SPR共振波长的提取更为准确。该数据处理方法或可作为高光谱SPRi等同类波长检测型SPRi装置的通用数据预处理步骤。

将聚苯乙烯微球的SPR图像与明场反射显微镜的成像结果进行对比，发现存在明显差异，主要与消逝场穿透深度的限制有关。相较于反射式明场显微镜图像，SPR图像无法展现超出消逝场的物体上表面的光散射信息，但能更加敏锐地反应物体下表面的接触情况。值得指出的是，对于超出消逝场穿透深度的微结构物质，SPR成像结果将失去物体尺寸衡量的能力。并且消逝场的穿透深度与金属层、介质层的性质以及入射光波长有关，样品与金属层的距离同时对介质层的等效折射率有影响，多重变量因子的存在使得波长检测型SPRi对微粒图像的量化解释面临挑战。