小分子药物BNTA通过上调Insig1缓解高胆固醇引起的骨关节炎

王俊雁， 曹宸喜， 胡晓青， 程 锦， 敖英芳

(北京大学第三医院运动医学科，北京大学运动医学研究所，运动医学关节伤病北京市重点实验室， 北京 100191)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是运动系统常见的关节退行性疾病，主要特征为关节软骨渐进性的降解和破坏。其发病率呈逐年上升趋势，且已成为全球第3大致残原因，给社会和家庭带来了沉重的经济负担[1,2]。

骨关节炎最重要的病理变化即为关节软骨的退变，其本质是软骨细胞外基质(extracellular matrix, ECM)分解代谢和合成代谢的失衡，造成分解代谢强于合成代谢，导致软骨组织出现降解[3]。当软骨细胞的合成代谢和分解代谢保持动态平衡时，细胞的分泌活动正常，因而ECM的主要成分—即II型胶原纤维(type II collagen, col2)和蛋白质多糖(aggrecan, ACAN)的含量正常。当软骨细胞的合成代谢降低，或者分解代谢活动增强时，软骨组织ECM出现渐进性降解和破坏，进而导致OA的发生和进展。

骨关节炎发病的危险因素众多。以往研究认为，OA软骨退变与衰老、创伤及生物力学异常有关。胆固醇(cholesterol)是维持人体正常生理过程的重要脂类，正常血总胆固醇含量为140～200 mg/dl，当血液中胆固醇含量增高时会引起高胆固醇血症，其与动脉粥样硬化、骨质疏松等疾病密切相关。而近期有研究认为，胆固醇代谢异常同样与OA软骨退变存在相关性，且可能为OA发病的独立危险因素[4,5]。软骨细胞内的高胆固醇堆积会导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)增高，激活异常氧化应激，损害线粒体功能，进而破坏软骨细胞ECM合成代谢与分解代谢的平衡，加重炎症反应，导致骨关节炎进展[6-8]。

在既往研究中，我们发现一种新的改善骨关节炎病情的化合物(disease-modifying OA drugs, DMOADs)— N-[2-bromo-4-(phenylsulfonyl)-3-thienyl]-2-chlorobenzamide(BNTA)，其在创伤诱导的大鼠OA模型中能有效改善中关节软骨组织ECM的含量，改善大鼠关节的疼痛症状及软骨下骨的硬化程度，延缓骨关节炎的进展[9]。研究证实，BNTA可有效清除细胞内过量的ROS，改善异常氧化应激，促进细胞的合成代谢，抑制分解代谢和炎症反应，达到治疗OA的效果。但对于BNTA能否改善高胆固醇诱发的OA，我们仍需进一步研究。本研究旨在探讨小分子药物BNTA是否能改善胆固醇代谢，缓解高胆固醇引起的骨关节炎。

1 材料与方法

1.1 BNTA来源、性质及使用方法

本研究中所使用的BNTA由上海陶素生化公司合成。BNTA化学式为N-[2-bromo-4-(phenylsulfonyl)-3-thienyl]-2-chlorobenzamide。配制方法：使用DMSO溶解化合物，用生理盐水或完全培养基进行稀释。细胞实验中，在培养基中加入溶解的BNTA，配制成所需浓度，在更换培养基时加入；动物实验中使用生理盐水稀释至所需浓度，采用膝关节腔局部注射方式给药。本研究中动物实验疗程为4周，用以观察BNTA对高胆固醇引起的OA的短期疗效，给药浓度为0.15 mg/kg，每周2次，给药剂量及频次参考先前的研究[9]。

1.2 动物模型

本研究所使用的SD大鼠购自北京大学医学部动物部。选取6周雄性SD大鼠，给予高胆固醇饮食喂养10周，构建高胆固醇饮食大鼠OA模型[10,11]。正常饮食组(Control Diet, CD)大鼠饲喂AIN-93 G饲料，高胆固醇饮食组(High-Cholesterol Diet, HCD)饲喂AIN-93 G+2%胆固醇饲料。本研究中的大鼠分为4组，每组6只。第1组为正常饮食组(CD组)；第2组为高胆固醇饮食组，饲喂10周后无特殊处理(NC组)；第3组为高胆固醇饮食组，饲喂10周后关节腔内注射与BNTA组等量的生理盐水(Vehicle组)；第4组为高胆固醇饮食组，饲喂10周后关节腔内注射0.15 mg/kg BNTA治疗(BNTA组)，每周2次，共4周。

1.3 原代软骨细胞分离与培养

大鼠原代软骨细胞取自体重150 g左右的雄性SD大鼠，将大鼠断颈处死，分离其股骨头及股骨髁表面软骨，剪碎后使用0.2%二型胶原酶在37 ℃培养箱中消化4 h，离心后弃上清，使用含10%胎牛血清的完全培养基重悬，铺于细胞培养皿中，于含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养。

为研究BNTA对高胆固醇引起的骨关节炎的治疗作用，本研究采用不同浓度胆固醇刺激大鼠软骨细胞3 d。第2 d时，在治疗组细胞的培养基中加入BNTA治疗24 h，处理完成后，固定细胞，进行后续实验。

1.4 实时定量PCR

使用TRIzol试剂分离并提取大鼠软骨细胞总RNA，每6 cm培养皿加入1 mL TRIzol试剂。依次加入三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇纯化RNA。使用逆转录试剂盒，对纯化的RNA (1 μg)进行逆转录。逆转录后的cDNA制备成15 μl体系，充分混合，加入96孔板中，离心后放入PCR仪，每个样本设置3个复孔。使用实时定量PCR(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR)系统(Applied Biosystems)检测软骨细胞中各基因mRNA相对表达量。扩增条件为95℃ 2 min，(95℃ 15 s，60℃ 30 s)共40个循环，并绘制溶解曲线。基因相对表达量以倍数变化率表示，用2-ΔΔCT公式计算，以Rn18 s作内参。本研究中涉及大鼠的引物序列见Table 1。

Table 1 Primer sequences for rat genes

1.5 甲苯胺蓝染色

配制甲苯胺蓝染液，过滤去除沉淀。使用10%中性甲醛固定细胞30 min，PBS冲洗3次后加入甲苯胺蓝染液，染色5 min，充分洗去染液，滴加少量蒸馏水在显微镜下观察。

1.6 油红O染色

使用10%中性甲醛固定细胞30 min，PBS冲洗3次加入60%异丙醇浸洗5 min，弃去异丙醇后加入新配制的油红O染液浸染20 min，充分洗去油红O染液，用苏木素染液复染核2 min，洗净后加少量蒸馏水在显微镜下观察。甲苯胺蓝染色及油红O染色使用Image J软件对染色强度进行统计分析，计算方法为染色面积/细胞总面积(%area)。每个样品至少采图6个视野。

1.7 免疫组化染色

石蜡切片使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各15 min，依次浸入100%、95%、85%、70%、50%酒精各5 min，PBS洗涤后浸入3% H2O2中避光浸泡15 min，PBS洗涤后使用4%胃蛋白酶修复抗原1 h，PBS洗涤并使用PBST打孔15 min，使用5%BSA封闭1 h，1∶100稀释一抗，4 ℃孵育过夜。PBS洗涤并加入1∶200稀释的二抗，孵育2 h，PBS洗涤并使用DAB显色2 ～ 10 min，ddH2O终止反应。使用梯度酒精脱水，二甲苯透明10 min，中性树脂封片。

1.8 Western 印迹分析

配胶：配制分离胶和浓缩胶。上样：将20 μg对应体积蛋白质样品和10 μL蛋白质标准分子量(marker) 按照要求依次加入上样孔。依次进行电转、电泳和封闭。孵一抗：用5%脱脂奶粉稀释一抗，置于摇床中4 ℃孵育过夜。洗膜：用TBST在摇床上室温(21 ℃)洗膜3次，每次10 min。孵二抗：选用与一抗对应辣根酶标记二抗，加入PVDF膜中，置于摇床中室温(21 ℃)孵育1 h。二次洗膜：用TBST在摇床上室温(21 ℃)洗膜3次，每次10 min。化学发光：ECL显色液反光底物A液和B液等体积混合，滴加于PVDF膜上孵育30 s。随后用BIO-RAD ChemiDoc XRS+ system凝胶成像系统进行曝光成像。

1.9 OARSI评分

本研究采用国际骨关节炎研究协会软骨退变评分系统(Osteoarthritis Research Society International score，OARSI)来评价关节软骨的退变程度[12]。OARSI等级(grade)分为6级，评分越高，软骨退变越严重。0级：正常，软骨表面和软骨细胞均正常；1级：关节软骨表面出现少量纤维化，不平坦，但未见软骨损失，未累及但中层和深层软骨；2级：关节软骨表面出现裂隙和软骨损失，中层软骨受累，出现纤维化、软骨细胞增殖和死亡、软骨基质染色异常等；3级：裂隙累及深层软骨，软骨细胞死亡和增殖主要沿裂隙分布；4级：裂隙周围的基质丢失，关节软骨侵蚀；5级：关节软骨剥蚀，未矿化的透明软骨全层侵蚀，矿化的软骨和软骨下骨裸露于关节表面；6级：关节变形，关节面纤维软骨化、骨赘形成等。

本研究中OARSI评分由2名具有临床工作经验的运动医学科医生对照评分细则在光学显微镜(X100)下独立完成，取评分均值作为最终得分，未告知样本分组。

1.10 统计学方法

所有统计分析均使用SPSS(版本20.0，IBM Corp)进行。数据表示为平均值 ± 标准差。每个独立的数据点代表独立的生物学样本。本研究采用Shapiro-Wilk检验进行数据的正态性检验，Levene检验用于数据的方差齐性检验。两组数据之间的差异采用two-tailed Student’st-tests，三组及以上数据采用one-way ANOVA，两种影响因素水平的组间比较采用2×2析因方差分析。P<0.05为具有统计学显著意义差异。结果中表示为：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2 结果

2.1 BNTA可缓解高胆固醇大鼠骨关节炎模型的病理表现

为探究BNTA对高胆固醇引起的骨关节炎的作用，通过饲喂高胆固醇饮食构建了大鼠OA模型，并通过关节腔局部注射的方式给予BNTA治疗。大鼠膝关节石蜡切片番红O染色显示，高胆固醇饮食大鼠较正常饮食大鼠表现出更严重的OA表型。表现为关节表面不光滑、番红O染色及二型胶原纤维(type II collagen, col2)免疫组化染色强度降低，Mmp13(matrix metalloproteinases 13)免疫组化染色强度增高，说明关节软骨ECM蛋白多糖含量减少，而BNTA治疗能显著增加蛋白质多糖和二型胶原含量，有效改善上述膝关节软骨组织的退行性病变，缓解OA进展(Fig.1A)。采用OARSI评分对大鼠膝关节OA的严重程度进行评分。结果显示，高胆固醇饮食组大鼠内侧胫骨平台(medial tibial plateau，MTP)和内侧股骨髁(medial femoral condyle，MFC)的OARSI评分均高于正常饮食组大鼠，BNTA治疗组评分有所改善，表明BNTA治疗组的膝关节软骨组织退行性病变较轻(Fig.1B)。对Col2和Mmp13免疫组化进行评分同样显示该趋势(Fig.1C)。结果提示，BNTA能缓解大鼠高胆固醇引起的OA的进展。

Fig.1 BNTA alleviates the pathological manifestations of OA in the OA model of high cholesterol rats (A) Safranin O staining of paraffin sections of rat knee tissue, scale bar = 500 or 100 μm, and immunohistochemical staining of Col2 and Mmp13, scale bar = 50 μm. Six-week-old Sprague-Dawley rats were fed with high-cholesterol diets for 10 weeks, and then treated with local injection of BNTA in the joint cavity twice a week for 4 weeks. CD, control diet, HCD, high fat diet; NC, no special treatment, Vehicle, injection of the same amount of normal saline as BNTA treatment group, BNTA, injection of 0.15 mg/kg BNTA treatment. (B) The OARSI score of knee joints in rats. (C) Positive cell statistics of Col2 and Mmp13. (n=6). ns, no statistical difference; *, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001; ****, P<0.0001

2.2 BNTA可缓解高胆固醇刺激引起的骨关节炎表型，减少大鼠软骨细胞脂质积聚

随后评估了大鼠软骨细胞中相关基因的表达量，包括合成代谢相关基因：col2、sox9(Sry-box transcription factor 9)、acan(aggrecan)和分解代谢相关基因：mmp13、adamts5(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 5)。结果显示，高胆固醇刺激可下调软骨细胞ECM合成代谢相关基因的表达，上调ECM分解代谢相关基因的表达。BNTA治疗能逆转大鼠软骨细胞中高胆固醇刺激引起的OA表型，说明BNTA可以改善软骨细胞代谢过程，缓解大鼠软骨细胞中的OA进展(Fig.2A)。免疫荧光结果也反映了上述趋势在蛋白质水平的变化(Fig.2B)。

Fig.2 BNTA ameliorates the OA phenotype of rat chondrocytes induced by high cholesterol (A) The expression of col2, acan, sox9, mmp13, adamts5 genes in rat chondrocytes was detected by RT-qPCR. (B) Immunofluorescence staining of col2, sox9 and mmp13, scale bar = 75 μm. The high cholesterol group (chl) was treated with 50 μg/mL cholesterol for 72 hours, and the BNTA treatment group (chl +BNTA) was treated with 50 μg/mL cholesterol for 72 hours. BNTA was added at a 0.1 μmol/L concentration for 24 hours, and the control group (con) was added with the same amount of saline. Ns, no statistical difference; ***, P <0.001; ****, P <0.0001

为探究BNTA对大鼠软骨细胞的保护作用和对大鼠软骨细胞脂质积聚情况的影响，我们在原代培养的大鼠软骨细胞培养基中添加50 μg/ml浓度高胆固醇刺激，随后采用0.1 μmol/L BNTA治疗。治疗完成后，固定细胞进行甲苯胺蓝和油红O染色。甲苯胺蓝染色结果显示，胆固醇处理后，软骨细胞减少，染色强度下降，说明软骨细胞ECM出现降解和蛋白质多糖丢失。相较于单纯胆固醇处理组，BNTA治疗组中胆固醇引起的细胞数量减少程度和甲苯胺蓝染色强度下降程度均减轻，提示BNTA治疗能改善大鼠软骨细胞中胆固醇引起的ECM降解和细胞死亡，延缓OA进展；油红O染色显示，高胆固醇刺激后软骨细胞内脂滴显著增加，BNTA治疗后脂滴含量明显减少，提示BNTA治疗能缓解高胆固醇刺激引起的细胞内异常脂质积聚(Fig.3)。

Fig.3 BNTA ameliorates increased lipid accumulation in rat chondrocytes induced by high cholesterol stimulation Toluidine blue stain and Oil Red O staining of rat chondrocytes (A), and statistical analysis (B). Primary rat chondrocytes (p1) were cultured and treated with 50 μg/mL cholesterol for 72 hours in the high cholesterol group, 50 μg/mL cholesterol for 72 hours in the BNTA treatment group, followed by 0.1 μmol/L BNTA treatment for 24 hours, and the control group was treated with the same amount of saline. Toluidine blue stain and Oil Red O staining were performed after the intervention. The red dots in the figure are lipid droplets. Scale bar = 200 or 100 μm, ns, no statistical difference; ***, P <0.001; ****, P <0.0001

2.3 BNTA对高胆固醇刺激的大鼠软骨细胞胆固醇代谢相关基因的影响

在上述结果中，本文观察到BNTA能显著改善软骨细胞内的脂质积聚。为明确BNTA的作用机制，检测了胆固醇代谢相关基因的表达变化情况。胆固醇稳态主要由2个关键角色维持，固醇调节元件结合蛋白2-切割激活蛋白质复合物(sterol regulatory element-binding protein 2-cleavage-activating protein complex, SREBP2-SCAP复合物)和转录因子肝X受体(liver X receptor，LXR)。SREBP2-SCAP复合物对胆固醇稳态的调控依赖于胰岛素诱导基因1 (Insig1)等调控因子，当Insig1表达上调时，可通过抑制SREBP2、上调Insig1降低细胞内胆固醇[13]。而LXR作为转录调控因子，激活时可促进外排转运蛋白ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)表达上调，介导巨噬细胞、肝细胞和肠道细胞的胆固醇外排[14]。

RT-qPCR结果显示，高胆固醇刺激时，促进胆固醇外排的基因ABCA1、LXR-α、LXR-β表达显著升高，BNTA治疗后无显著改变；BNTA处理后，细胞内胆固醇生物合成相关基因SREBP2表达下调，Insig1表达上调，提示BNTA能影响胆固醇代谢相关基因的表达，通过上调Insig1表达，改变细胞内的胆固醇稳态缓解高胆固醇刺激引起的脂质积聚(Fig.4A)。Western印迹结果也反映了上述基因在蛋白质水平的变化趋势。结果显示，高胆固醇可引起SREBP2明显上调，BNTA治疗后可下调SREBP2(Fig.4B)。

2.4 BNTA可上调高胆固醇大鼠骨关节炎模型中的Insig1表达

为进一步明确BNTA对高胆固醇诱导的OA大鼠膝关节软骨Insig1的影响，本文进行了insig1免疫组化染色。结果显示，高脂饮食组相对正常饮食组大鼠Insig1表达显著下调，BNTA治疗可增高高脂饮食组大鼠的Insig1表达，提示BNTA能通过升高Insig1，影响胆固醇稳态，缓解OA进展(Fig.5)。

Fig.5 BNTA treatment up-regulated Insig1 expression in the OA model of rats with high cholesterol diets Six-week-old Sprague-Dawley rats were fed with high-cholesterol diets for 10 weeks, and then treated with local injection of BNTA in the joint cavity twice a week for 4 weeks. CD, control diet, HCD, high fat diet; NC, no special treatment, Vehicle, injection of the same amount of saline as the BNTA treatment group, BNTA, injection of 0.15 mg/kg BNTA treatment. Scale bar = 50 μm, **, P <0.01; ****, P <0.0001

3 讨论

近年来，以胆固醇代谢紊乱为主的代谢综合征在OA的发病机制研究中逐渐受到重视。研究表明，高胆固醇饮食可诱发大鼠膝关节退行性病变，且可作为诱发OA的独立因素[15,16]。本研究采用高胆固醇饮食诱导大鼠OA模型，通过体内实验探究高胆固醇与OA的关系。组织学分析显示，大鼠饲喂10周，HCD组软骨破坏程度明显高于CD组，蛋白质多糖含量显著减少，OA表型加重。在体外细胞实验中，采用外源性胆固醇刺激大鼠软骨细胞。结果显示，软骨ECM合成代谢基因Col2，Acan，Sox9表达下调，软骨ECM分解代谢相关基因Adamts5，Mmp13表达上调。体外细胞结果与体内结果一致，即经高浓度胆固醇处理的软骨细胞，软骨基因改变，表现出退行性改变，证实高胆固醇是OA的危险因素，可引起OA软骨的退行性变。

本研究通过关节腔注射给药方式探究小分子药物BNTA在高胆固醇大鼠OA模型中的作用。组织学评估证实，BNTA治疗可改善高胆固醇引起的大鼠骨关节炎，表现为关节表面情况改善、蛋白质多糖含量增加等。RT-qPCR结果显示，BNTA治疗可以逆转高胆固醇刺激所引起的ECM合成代谢与分解代谢相关基因改变，延缓OA进展。以上结果表明，BNTA对高胆固醇诱发的OA具有缓解作用。

既往研究表明，软骨细胞内的胆固醇堆积会造成线粒体结构和功能的损伤，激活炎症信号通路，使软骨细胞发生不可逆损伤，引发软骨退变[17]。胆固醇的稳态受多种细胞表面受体调节。SREBP2-SCAP复合物定位于内质网，发挥胆固醇传感器的作用。当细胞内胆固醇水平较高时，Insig蛋白将SREBP蛋白固定在内质网膜上，阻止靶基因转录，从而阻止胆固醇的生物合成；当细胞内胆固醇水平较低时，Insig允许SREBP被转移到细胞核，激活转录并恢复胆固醇稳态。研究认为，高胆固醇可增加大鼠软骨细胞内脂质积聚，而调节血脂的药物能通过抑制SREBP2降低细胞内胆固醇[18,19]。LXR作为转录调控因子，在肝、脂肪组织和巨噬细胞中高度表达，高浓度胆固醇可激活LXR，促进外排转运蛋白ATP结合盒转运体A1表达上调，增加胆固醇外排[20,21]。在OA关节软骨组织中，胆固醇外流相关基因ABCA1和肝X受体(LXRα和LXRβ)表达明显低于正常，而LXR激动剂能通过促进胆固醇外排治疗OA[22,23]。

本研究结果显示，高胆固醇刺激可引起软骨细胞脂质异常积聚。BNTA治疗后，细胞内脂质积聚显著减少。在软骨细胞中，高胆固醇刺激上调Insig1、LXR-α、LXR-β和ABCA1，可能由于细胞内短期胆固醇增高使细胞发生代偿调节，上调Insig1减少胆固醇生物合成，激活LXR促进胆固醇外排。BNTA治疗可减少软骨细胞内的脂质积聚，显著上调Insig1，抑制SREBP2。在高胆固醇大鼠OA模型中，HCD组的大鼠Insig1表达下降，可能由于长期高胆固醇饮食导致血脂升高，细胞长期处于高胆固醇环境，调节机制受损，阻止胆固醇生物合成的Insig1蛋白表达下降。而BNTA治疗后Insig1表达升高，OA缓解。以上结果提示，BNTA对高胆固醇引起的OA的治疗作用可能与上调Insig1，减少胆固醇的生物合成相关。本研究仍存在一定局限性，未对BNTA是否对SREBP2-Insig1具有直接调控作用进行验证，这将在未来的研究中进行补充和深入探究。

综上所述，本研究通过体外和体内研究证实，高胆固醇可诱发OA，引起软骨细胞脂质积聚增加。BNTA治疗能缓解高胆固醇引起的OA，通过升高Insig1改善软骨细胞内的异常脂质积聚。本研究提示，小分子药物BNTA治疗能影响细胞中的胆固醇代谢，对高胆固醇引起的OA具有治疗潜力。