佤药益气通络方单药和组方成分对比及急性毒性研究*

海青山，赵 杰，左爱学，金亚菊，李明明，高 磊，李仪杰，王丽欢，温伟波△

（1.云南中医药大学基础医学院，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第一临床医学院，云南 昆明 650500；3.云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500；4.云南中医药大学针灸推拿康复学院，云南 昆明 650500；5.云南中医药大学民族医药学院，云南 昆明 650500）

佤族医药是民族医药的重要组成部分，有其独特的用药经验，但由于缺乏文字，没有形成完整的理论体系且多有散失，亟待整理研究[1]。依据前期调研结果，本课题组选取3味佤族常用药拟成益气通络方。方中以地桃花为君，味甘、辛，性平，具有益气补虚，祛风利湿之功效；鸡根为臣，味甘，性温，具有补气活血，祛风利湿之效；佐以滇鸡血藤，味苦、甘，性温，具有活血补血，舒筋通络之功，3药合用共奏益气活血、通络止痛之功法。全方重用补气药，配伍少量活血药，使祛瘀通络以治标，气旺血行以治本，对气虚血瘀为根本病机的多种风湿痹证达到标本兼顾的效果。前期实验证明，该方可增加糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）模型大鼠坐骨神经LC3-II及Beclin1蛋白的表达，下调p62表达，促进自噬的发生，显著改善DPN大鼠神经元病理表现[2]。鉴于地桃花、鸡根、滇鸡血藤3味药的化学成分研究较多，本文试着以3味单药为参照，对比混合煎煮和单独煎煮的成分变化，推测益气通络方的化学成分，并对该方的急性毒性进行研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 地桃花、鸡根、滇鸡血藤生药采自云南省临沧市沧源佤族自治县，经云南中医药大学药物鉴定教研室鉴定为正品。Agilent-1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）、T-1000型电子天平［美国双杰（兄弟）集团有限公司］，AB265-S型分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］、乙腈-磷酸水溶液。

1.2 动物 昆明种小鼠（贝斯福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0010；实验单位使用许可证号：SYXK（滇）K2018-0003），体质量18～22 g。

1.3 方法

1.3.1 药材煎煮 称取地桃花4 g，鸡根3 g，鸡血藤6 g分别放入500 mL烧杯中，另取益气通络方样品13 g（按原方比例，地桃花 ∶鸡根 ∶鸡血藤 =4 ∶3 ∶6）也放入500 mL烧杯中。加入10倍量的蒸馏水，将烧杯置于98℃恒温水浴锅中加热2 h，将提取药液用布氏漏斗抽滤，得到滤液后经旋转蒸发仪蒸干得到各样品的浸膏，各组的浸膏重量分别为鸡血藤0.2 g，鸡根0.1 g，地桃花1.2 g及益气通络方混提样品1.4 g。

1.3.2 益气通络方不同煎煮方式的成分对比 高效液相色谱法检测，色谱条件：Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）进行梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长分别为210 nm、254 nm、280 nm和320 nm。

1.3.3 急性毒性实验 小鼠100只，雌雄各半，禁食不禁水12 h后，按性别比例各半随机分为10组。参照人和动物间体表面积折算等效剂量的比值[3]，以体表面积换算成小鼠的等效剂量为每天8.38 g/kg，选择组间比例0.7依次递增，共设计8个剂量组，分别为8.38、11.97、17.1、24.43、34.9、49.86、71.23、101.76 g/kg；溶媒对照组，给予等容积30 mL/kg生理盐水。每组10只，灌胃给药，单次给药后，观察各组动物的急性毒性反应和死亡情况，观察14 d后全部处死。根据动物的死亡情况以Bliss法计算LD50。另有1个最大浓度剂量组，即将浸膏溶至最大浓度，给予最大灌胃量，观察动物死亡和毒性反应情况。实验过程中，死亡动物或观察期满即处死动物，解剖观察它们的器官是否存在异常。

1.4 统计学处理 采用SPSS14.0软件对采集到的数据进行分析。LD50计算采用Bliss法，计量资料的组间比较采用t检验，P＜0.05时有统计学意义。

2 结果

2.1 益气通络方不同煎煮方式的成分对比 以醇提和水提2种不同的方法提取鸡血藤、鸡根、地桃花，进样量：10.0 μL 分别以 210 nm、254 nm、280 nm 和320 nm波长进行HPLC检测，考虑到基线的稳定性、吸收峰的差异性和临床用药习惯等因素，最终选取水提样品以254 nm波长测得HPLC图谱为主要参考，结果如图1、图2、图3所示。可见，在相同进样量和检测条件的情况下，鸡根和地桃花的水提物中化学成分更丰富。

图1 地桃花水提物HPLC指纹图谱（254 nm）

图2 鸡根水提物HPLC指纹图谱（254 nm）

图3 滇鸡血藤水提物HPLC指纹图谱（254 nm）

按照生药比例地桃花∶鸡根∶鸡血藤=4∶3∶6将3药水提物混合，得到提取物的混合溶液，以254 nm波长进行HPLC检测，结果如图4所示，其主要吸收峰基本出现在30 min以内，与3药单独检测的吸收峰基本对应，只是由于混合比例不同，幅度略有差异。

图4 地桃花、鸡根、鸡血藤水提物混合溶液HPLC图谱（254 nm）

以水提的方法得到益气通络方（地桃花∶鸡根∶鸡血藤=4∶3∶6混合）的提取物，分别以254 nm波长进行HPLC检测，得到指纹图谱，如图5所示，其主要吸收峰也出现在约30 min以内。

图5 佤药益气通络方水提物HPLC图谱（254 nm）

鉴于以上各谱图的吸收峰均出现在约30 min以内，将图 4、图 5放大对比（如图6所示）。除 6、7、8、9、10的幅度略有差异外，2个谱图的吸收峰紫外光谱对应的位置和形态基本一致。

图6 佤药益气通络方全和3药单独提取后混合物的HPLC图谱对比（254 nm）

进一步将图4和图5的HPLC图谱进行拟合，如图7所示。与单药提取后的混合溶液相比，仅2处吸收峰混提样品的幅度略升高外，2个谱图其余的吸收峰拟合度较高，或基本低于单药提取后的混合溶液。

图7 佤药益气通络方全和3药单独提取后混合物的HPLC图谱拟合（254 nm）

2.2 LD50计算 结果如表1所示：给药浓度从8.38 g/kg，以组间比例0.7等比设计8个剂量组至101.76 g/kg，均未见到动物出现死亡的情况，即LD50超过现有浓度的范围，理论上尚未检测到LD50的数值。溶媒对照组10只小鼠也未见死亡的情况。

表1 益气通络方急性毒性试验各组死亡率

鉴于以上实验结果，将益气通络方溶解至最大浓度，折合生药8.23 g/mL，一次性给予最大灌胃量，即每10 g体质量给予0.3 mL，折合给药量为246.9 g/kg。以折合等效剂量8.38 g/kg为参照，最大给药量达到等效剂量的29.5倍，仍未见到动物出现死亡的情况。结果如表2所示。

表2 益气通络方最大浓度的急性毒性试验死亡率检测

2.3 急性毒性一般观察 给药后，各浓度组动物摄食、饮水、活动、呼吸、探究行为等反应均无明显变化，各浓度组均无惊厥、抽搐等反应。少数动物出现呕吐、流涎等反应，由于溶媒对照组也出现类似症状，考虑到灌胃刺激，不予纳入毒性表现。观察14天后处死动物并解剖，肉眼检查各组织和脏器的体积、颜色、质地等，均未见淤血、肿胀、炎症、结节等明显异常。

3 分析

地桃花、鸡根、滇鸡血藤3味单药的成分、药理和组方的研究中均有报道。地桃花（Urena lobata L.）为锦葵科植物肖梵天花的根或全草，化学成分方面的报道已经较为全面，已知有130多个化合物，主要包括黄酮类、木脂素类、大柱香波龙烷类、酚酸类等，是我国佤族、壮族等少数民族常用药，药理研究显示其具有抗炎、抑菌、抗氧化等作用，在花红胶囊、花红片、花红颗粒等成药中均有应用，在广西、湖南等地方标准中已有收录[4-6]。鸡根（Polygala arillata Buch-Hum）为远志科植物黄花远志的根茎，其化学成分包括有三萜皂苷类、香豆素类、生物碱类、黄酮类、挥发油类、酚类、鞣质、糖类、甾醇类及氨基酸类等，中药材云南地方标准已有收录，是佤族、白族、彝族、傣族、拉枯族等多个民族的常用药，广泛用于治疗风湿疼痛、炎症等，在止咳平喘丸等成药中有应用[7-9]。滇鸡血藤（Kadsura interior A.C.Smith）为木兰科植物南五味子的藤茎，其化学成分主要以木脂素类、三萜类为主要生物活性成分，此外还含有挥发油、黄酮类等，是包括佤族在内的云南多个民族的常用药，中国药典有收录，药理研究显示其具有免疫调节、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，为复方鸡血藤膏等中成药中的主药[10-12]。

本文主要对佤药益气通络方的成分和急性毒性进行研究，即对3药混提可能出现的新化合物进行评测，对其安全性进行评价。首先，对于3药混提和分布提取的成分进行对比，可以推测，在混提中和单味药提取物的混合溶液相比，提取的化学成分在结构方面相同或非常相似，说明在混提的过程中并无新的化合物生成，即在组方过程中并未明显增加其安全性的不确定因素。益气通络方的安全性可以参照单药或其他现有成药的安全性。在LD50的检测过程中，8个梯度浓度均无动物死亡。以最大浓度和最大灌胃量给药，给药量为246.9 g/kg，折合生药给药量达到等效剂量的29.5倍，接近动物体重的四分之一，仍未见动物死亡，且生存状态良好，说明全方的配伍合理，安全性较好。

4 结论

地桃花、鸡根、滇鸡血藤为佤族常用药，当地佤族草医常用这3味药，以改善患者肢体麻、凉、胀、痛等临床症状。但佤医没有经络、气血津液、方剂配伍等理论体系，以对症治疗为主。在民族药深度开发的过程中，应该在少数民族用药经验的基础上，参照中医药性味归经理论，开展组方研究。

益气通络方取地桃花、鸡根、滇鸡血藤3药益气、通络、止痛的共同作用为基础，地桃花益气补虚作用更强；鸡根温补气血作用平和；滇鸡血藤活血补血作用突出。3味药各具特点，各有侧重，全方通中寓补，补中寓通，使补气而不壅滞，活血又不伤正，针对痹证日久，气虚血瘀的病机作用较好，这与DPN即消渴痹证患者的病证相似。DPN患者由于组织缺血缺氧导致神经细胞节段性脱髓鞘、轴突变性等病理损伤，进而出现四肢末端对称性麻木、蚁行、温度觉和痛觉减退、针刺样疼痛等症状[13]。可以对益气通络方治疗DPN进行深入研究，但需要进行必要的药理研究和安全性研究。

实验证明，益气通络方中3药混合煎煮后并未出现明显的成分改变，或生成大量新的化合物，未知的毒性反应基本可控。在急性毒性实验中，益气通络方表现出安全性较好，这一方面是由于具有较好的佤族用药经验基础，另一方面参照中医性味归经理论，配伍合理也可以有效降低毒性。

通过本实验的研究，证明族医药的用药习惯与中医药相类似，运用中医药理论体系阐释佤医药的用药经验，并开展相关机制研究的可行性较高。佤药的开发可以更多地借鉴中医配伍组方经验：形成新的方剂，拓展应用范围，明确治理指征，揭示作用机制。形成民族医药用药经验，加中医药理论体系，加现代医学药理研究的研究思路和模式。益气通络方的研究，在现代安全性评价标准的前提下，尚需要进一步深入化学成分、临床适应证等相关研究。