补阳还五汤治疗脊髓外伤性截瘫的作用机制*

郭德华，吴成林，许 洋，张国福

（1江西中医药大学，江西南昌 330004；2江西中医药大学附属医院，江西南昌 330006）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）属于中医理论“体惰”、“痿症”的范畴［1］，发生率在我国乃至全世界呈明显上升趋势［2］。SCI 的病理机制极其复杂，其治疗及康复是医学界的一大难点［3］。中医药治疗SCI发挥了中医整体观念的优势，能通过多路径、多层次和多靶位的机制，促进受损脊髓微环境的修复［4］。补阳还五汤（Buyang-Huanwu decoction，BYHWD）源自清代王清任《医林改错·卷下·瘫痿论》，是被用于改善SCI 后神经功能的经典方［5］，但其作用机制却一直研究甚少。JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信号通路是细胞内重要的信号传递途径，与细胞凋亡和神经再生休戚相关［6］。有研究表明，BYHWD 可能激 活JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信号途径，抑制神经元凋亡，缓解神经损伤［7］。另外，本研究前期研究发现，BYHWD 促进SCI 后运动功能的恢复［8-9］；因此，我们猜想BYHWD 可通过激活PI3K/AKT 和JAK2/STAT3双信号通路促进脊髓功能恢复，从而达到治疗SCI的作用。

材料和方法

1 试剂与仪器

BYHWD 组成：桃仁10 g，川芎10 g，当归10 g，生黄芪60 g，赤芍10 g，地龙10 g，红花10 g。以上饮片均购于江西中医药大学附属医院中药房，均为江西江中中药饮片有限公司产品，经江西中医药大学附属医院中药库李晓芳副主任中药师按照2015 版《中国药典》对中药复方BYHWD 中不同产地、批次每味药材进行水分、总灰度、浸出物、含量测定、定性鉴别等药物质控相关内容进行鉴定，均符合2015 版《中国药典》质量标准。按照中药煎药规定，将药汤浓缩至200 mL 备用，相当于临床等效药物浓度0.6 g/mL［10］。5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU）、鼠抗人BrdU 单克隆抗体和DAB 显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；山羊抗兔β-actin、p-AKT、p-JAK2、p-STAT3、gp130 和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；免疫组化试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；荧光显微镜和倒置显微镜（OLYMPUS）。

2 实验动物与分组

SD 大鼠27只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号为SCXK（湘）2019-0004，雌性不限，8 周龄，200～250 g，饲养于洁净环境中，温度（23±2）℃，湿度40%～70%，自由饮食摄水，12 h 光暗交替，所有动物适应性喂养7 d后开始正式实验。将27只大鼠分为假手术（sham）组9 只和造模组18 只，造模成功后随机分为2 组：模型（model）组和BYHWD治疗组（BYHWD 组）。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查通过［许可证号：SYXK（赣）2017-0004］。

3 主要方法

3.1 SCI 模型的建立 所有动物适应性喂养7 d 后开始正式实验，造模采用Allen 重物打击法制作SCI模型，保持硬膜完整性，造成大鼠脊髓重度损伤致完全性截瘫。SCI 造模成功的标志：在Allen 装置撞击脊髓的瞬间，动物身体发生抖动，大鼠双下肢快速产生回缩和弹动动作，尾巴瞬间翘起并迅速倒下，受损脊髓局部表面呈淤紫色，术后大鼠双下肢出现完全瘫痪。术后将动物置于保温垫上直至苏醒。假手术组大鼠只暴露其第10 胸椎段脊髓，不撞击该段脊髓，依次缝合肌肉、皮肤，关闭切口。

3.2 术后给药及护理 假手术组及模型组行生理盐水灌胃；BYHWD 组按照每次25 g/kg［10］（该剂量为课题组前期实验得出的最佳实验剂量）进行灌胃给药。造模结束后，将所有大鼠均置于25 ℃的动物房内统一饲养，将垫有锯末的平板置于大鼠笼中，以防肢体或骶部压疮及吸收排尿，并及时更换。手术结束后人工排尿，每天2次，各大鼠均连续排尿2周，直至大鼠恢复自主排尿时停止。

3.3 行为学观察 采用双盲、双人独立观察记录，在术后1、3、5 周进行行为学评分观察，采用改良Tarlov 评分和斜板试验。改良Tarlov 评分：0 和1 分，没有自主性的运动，只限于非反射性的髋、膝关节运动；2 分，髋、膝、踝三个关节的肢体运动；3 分，行走时可主动支撑体重和不协调步态或偶尔出现协调步态；4 分，活动时呈现前后肢协调步态，行动时有趾间关节的肢体运动；5 分，正常步态。斜板试验：在长方形木板上，将大鼠头部朝前，身体纵轴与倾斜板纵轴垂直放置，逐步增加倾斜板与水平面之间的夹角，使大鼠在原有位置上刚好保持5 s，这一夹角即为倾斜平面临界角度。记录各组大鼠倾斜平面临界角度。

3.4 免疫组化检测脊髓组织中BrdU 的水平 麻醉大鼠并开胸，将损伤区的脊髓组织切取1.5 cm，用中性的甲醛溶液固定，石蜡包埋后制成3 µm 的切片，用免疫组化法检测BrdU 细胞表达情况，于显微镜下观察。用ImageJ软件分析细胞BrdU吸光度。

3.5 Western blot 检测 处死各组大鼠，取20 mg 脊髓组织，将在冰上研磨组织呈粉末状，将裂解液加入到组织中，制成组织悬液后离心，对蛋白样本总浓度进行测定。转移蛋白样品至PVDF 膜，将入5%脱脂奶粉溶液，封闭样品2 h。蛋白样品中分别加入Ⅰ抗（p-AKT、p-JAK2、p-STAT3、gp130、IL-6 和内参照βactin 抗体），孵育后洗涤蛋白样品，将Ⅱ抗（1∶2 000）加入蛋白样品中，室温孵育1 h。用ECL 液显色，ImageJ软件观察条带灰度值并计算蛋白表达。

4 统计学处理

应用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。实验数据结果采用均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 SCI大鼠治疗前后行为学结果

与假手术组相比，模型组中改良Tarlov评分和斜板试验倾斜平面临界角度均显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，BYHWD 干预后改良Tarlov 评分和斜板试验倾斜平面临界角度均显著上升（P＜0.05），见图1。

Figure 1.Behavioral results of rats with spinal cord injury before and after treatment.A：modified Tarlov score；B：inclined angle of inclined plate test.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.图1 脊髓损伤大鼠治疗前后行为学结果

2 免疫组化检测大鼠脊髓组织中BrdU的水平

与假手术组相比，模型组中BrdU 含量显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，BYHWD 治疗组中BrdU含量显著上升（P＜0.05），见图2。

3 Western blot 法检测大鼠脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130及IL-6蛋白水平

与假手术组相比，模型组大鼠脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130 及IL-6 蛋白水平均显著上调（P＜0.05）；与模型组相比，BYHWD 治疗组大鼠脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130 及IL-6蛋白水平均显著下调（P＜0.05），见图3。

讨 论

研究表明，中医药在减轻SCI 症状，缓解SCI 并发症等方面发挥重要作用［11-12］。现代中医认为SCI是因为外力损伤督脉，致使气乱血逆，瘀阻经络，气血不能温煦濡养肢体所致。BYHWD 重用补气药与少量活血药相伍，使气旺血行以治本，祛瘀通络以治标，标本兼顾；且补气而不壅滞，活血又不伤正。合而用之，则气旺、瘀消、络通，诸症向愈。本实验研究结果表明，BYHWD 干预后SCI 大鼠的改良Tarlov 评分及斜板试验倾斜平面临界角度明显增加，恢复了SCI 大鼠后肢运动功能，证明了BYHWD 对SCI 具有治疗作用。鉴于BYHWD 在实验研究［8-10，13］干预中的疗效确切，本研究未设阳性对照组。

IL-6 作为炎症细胞分化的重要影响因子，而gp130作为IL-6等多种细胞因子的信号传导链，参与了神经神经系统的调节过程及急性SCI 的继发性损害［14-16］。本研究结果发现，SCI 后gp130 和IL-6 的蛋白表达水平显著上升，BYHWD 干预后gp130 和IL-6的蛋白表达水平显著下调。这表明大鼠SCI 后发生严重的炎症反应，而BYHWD 能够缓解SCI后的炎症反应。究其原因，正常情况下，神经系统内IL-6 水平表达比较低，但一定浓度的IL-6 是维持神经细胞正常生长和生存的基础，而且还会影响神经细胞的分化、生长和生存。IL-6 对中枢神经系统的影响是双向的，不仅可以促进激活的巨噬细胞分化和浸润，还可以上调其他细胞因子的表达，从而加强炎症反应。相关研究表明，IL-6 过度表达引起脊髓继发性损伤的同时也促进神经干细胞向神经胶质细胞分化［19］。BYHWD 可能通过抑制SCI 后IL-6 过度表达，调控神经干细胞的分化，从而减轻SCI。

Figure 2.The BrdU positive cells in injured spinal cord tissues were detected by immunohistochemistry（×200）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.图2 免疫组化检测各组受损脊髓组织BrdU阳性细胞水平

目前涉及BYHWD 的信号通路有多种，其中PI3K/AKT 和JAK2/STST3 信号通路均介导SCI 的发生发展。目前研究发现，JAK2/STAT3、PI3K/AKT 信号通路参与调节神经突生长和神经元迁移，在细胞的增殖、凋亡、分化和免疫应答中发挥重要调控作用［17-19］，是近年来备受关注的细胞因子信号转导通路。因此抑制JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信号通路被认为可能是治疗SCI 的方法之一［20-21］。多功能细胞因子IL-6 在正常脑组织中表达较少，在神经疾病脑组织中高表达，可见IL-6 可介导神经系统疾病的神经元修复；在神经元细胞内IL-6 可激活JAK2/STAT3信号通路，进而发挥生物学作用；gp130 作为IL-6 等多种细胞因子受体中的共用信号传导链，本身不具有酪氨酸激酶活性，但可通过介导IL-6 进行信号转导。因此，我们猜想JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 是2条独立的信号通路，BYHWD 可能介导IL-6家族共用信号传导亚单位gp130下游的信号激活传导双通路。本研究结果发现，SCI后损伤中心区域的脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3 和p-AKT 的蛋白水平显著上升，BYHWD 干预后p-JAK2、p-STAT3 和p-AKT 的蛋白水平显著下调。这表明大鼠SCI 可能激活了JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 双信号通路，而BYHWD 抑 制JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 双信号通路的激活，从而影响SCI 的相关病理过程。我们认为BYHWD 减轻SCI 是通过抑制PI3K/AKT 和JAK2/STAT3 信号通路磷酸化起作用的。

综上所述，BYHWD 能够减轻SCI，降低受损脊髓组织中gp130、IL-6、p-JAK2、p-STAT3 及p-AKT 蛋白水平，促进大鼠脊髓外伤性截瘫后运动功能的恢复。其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 双信号通路及减轻SCI 后损伤中心区域的炎症反应有关。考虑中医药治疗SCI具有多层次、多靶点的特点，我们将进一步分析BYHWD 及其提取物对JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信号通路及脊髓相关细胞的影响，并深入探究其可能的作用机制。

Figure 3.Western blot was used to detect the protein levels of p-JAK2，p-STAT3，p-AKT，gp130 and IL-6 in injured spinal cord tissues at different time points.A：1 week；B：3 weeks；C：5 weeks.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.图3 Western blot检测各时点受损脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130及IL-6蛋白水平