白细胞介素33通过增强炎症反应加重脂多糖诱导的急性肾损伤*

付 阳，董一飞

（南昌大学第二附属医院心血管内科，江西南昌 330006）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种常见危重症，是指肾功能在短时间内突然下降引起血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）显著升高的临床综合征，可由多种病因引起，如脓毒症、休克和心肌梗死等［1-3］。AKI的发病率和死亡率在世界范围内呈逐渐升高趋势，每年大约有近200 万的病死率，造成严重的医疗安全问题［4］。一般来说，AKI 的病程是短程的，但长时间患病会引起肾脏功能障碍，并最终发展成为慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）［5］。脓毒症（sepsis）是引起AKI 的主要原因之一，会导致微血管功能障碍、炎症和小管损伤等许多病理改变［6-7］。目前对AKI 的病理机制研究已很透彻，但临床治疗手段有限，因此，亟需寻找新的、有效的AKI治疗方法。

白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）是新近发现的一种细胞因子，属于IL-1 家族，可由上皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、树突状细胞、间质成纤维细胞等多种细胞合成分泌［8-12］。当IL-33 与其受体ST2结合后，能发挥多种生物学特性［13］。有报道指出，IL-33通过增强炎症反应和增加微血管通透性加重脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠急性肺损伤［14］。而另有其它研究显示，IL-33 在一些炎性疾病中具有保护作用［15］。目前，对IL-33 在炎性疾病中的确切作用机制仍不清晰，有待进一步研究。

本研究拟采用LPS 构建脓毒症所致AKI 小鼠模型，探索IL-33在AKI中的作用及其可能的机制。

材料和方法

1 动物和试剂

6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重（22±3）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；IL-33 购自Enzo Life Sciences；LPS购自Sigma；IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒购自Invitrogen；蛋白提取试剂盒购自苏州碧云天生物技术研究中心；抗IL-1β、IL-6、TNF-α、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、IL-33 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗体均购自Abcam；相应Ⅱ抗购自Proteintech。

2 动物模型

小鼠饲养在南昌大学江西医学院动物管理中心，光照/黑暗周期为12 小时，饮水和食物自由。饲养环境温度保持在（22±3）℃，湿度保持在（54±6）%。小鼠适应性饲养环境约7 d。然后将小鼠随机分为3组：（1）control组（n=8）：小鼠在整个实验过程中均给予腹腔注射磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS），不使用其他试剂；（2）LPS 组（n=8）：小鼠腹腔注射等体积的PBS，6 h 后再注射LPS（10 mg/kg），24 h 后处死小鼠；（3）LPS+IL-33 组（n=8）：小鼠先腹腔注射IL-33（50 µg/kg），6 h 后再注射LPS（10 mg/kg），24 h 后处死小鼠。注射试剂的方式和剂量参照以前的研究［16-17］。小鼠处理流程总结见图1。所有小鼠的处理均经南昌大学第二附属医院动物管理委员会批准，实验均按照相关指南和规定进行。

Figure 1.A summary of treatment procedure in mice.PBS：phosphate-buffered saline；LPS：lipopolysaccharide；IL-33：interleukin-33.图1 小鼠处理流程总结示意图

3 SCr和BUN测定

处死小鼠后，用真空管从右心室取得全血。然后用离心机在4 ℃、4 000×g离心30 min，提取出血清。采用BS-800化学分析仪（迈瑞公司）自动检测各组肾损伤标志物SCr和BUN水平。

4 ELISA法检测血清中炎症因子水平

血清中炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的检测采用相应的ELISA 试剂盒。具体操作流程按试剂盒提供的实验说明进行。

5 HE染色

收集的肾组织立即用4%甲醛固定，经酒精脱水后，采用石蜡包埋（5µm），然后用苏木精/伊红染色，最后用光学显微镜观察组织切片。肾损伤评分用于评估肾损伤程度。

6 Western blot法检测相应蛋白表达变化

采用蛋白提取试剂盒提取肾组织的总蛋白溶液，按比例将总蛋白溶液和上样缓冲液均匀混合，置于100 ℃水中10 分钟使其变性，蛋白上样量为50µg。使用10%的SDS-PAGE 分离总蛋白，然后将分离的蛋白通过转膜至PVDF 膜上，最后用5%的牛奶封闭该膜1 h。特定的蛋白条带采用相应的一抗在4 ℃冰箱中孵育约24 h，取出后用相应的二抗在室温条件下孵育约1 h。最后，使用增强型化学发光检测试剂盒和相应的扫描仪来检测蛋白质条带。

7 统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析。实验数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 LPS能增加肾组织中IL-33的表达

如图2 所示，小鼠肾组织IL-33 蛋白表达水平在LPS 刺激后显著增加。该结果证明，IL-33 的表达与LPS的刺激密切相关。

Figure 2.The protein expression of interleukin-33（IL-33）was markedly up-regulated by stimulation of lipopolysaccharide（LPS）.The protein expression of IL-33 was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group.图2 LPS能增加小鼠肾组织中IL-33的表达

2 IL-33预处理显著加重LPS诱导的AKI

如图3A、B所示，与control组相比，LPS组中小鼠BUN 和SCr 水平在LPS 刺激后显著升高；而给予IL-33 预处理后，LPS+IL-33 组小鼠BUN 和SCr 水平进一步升高，表明IL-33 预处理可明显加重LPS 刺激引起的AKI。同时，ELISA 检测结果如图3C～E 所示，血清中炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平变化与BUN 和SCr 的变化一致，说明IL-33 预处理能明显加重LPS刺激引起的全身炎症反应。上述结果提示，IL-33 预处理可显著加重LPS诱导的AKI。

3 IL-33预处理加重LPS所致小鼠肾组织病理损伤

如图4 所示，与control 组相比，LPS 组小鼠肾组织结构明显被破坏，肾组织水肿明显，而IL-33 预处理显著增强了LPS 的肾损伤作用。该结果提示，IL-33 预处理能显著加重LPS 刺激所致的肾组织病理损伤。

4 IL-33预处理通过增强炎症反应加重LPS诱导的AKI

如图5 所示，与control 组相比，LPS 组小鼠肾组织中炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3）表达水平显著升高，而给予IL-33 预处理后，小鼠肾组织中炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3）表达水平进一步升高。上述结果表明IL-33 预处理可通过增强炎症反应进一步加重LPS诱导的AKI。

5 IL-33预处理通过进一步激活NF-κB信号通路增强炎症反应

如图6 所示，与control 组相比，LPS 组小鼠肾组织NF-κB p65 磷酸化水平显著升高，而IL-33 预处理后NF-κB p65 磷酸化水平进一步升高。这一结果表明，IL-33 预处理可能是通过进一步激活NF-κB 信号通路增强炎症反应。

讨 论

AKI 是一种以肾功能损害为特征的复杂性疾病。根据之前的研究显示，急性肾功能衰竭（acute kidney failure，AKF）的主要病因是脓毒症，而脓毒症与AKI 的结合使AKF 的死亡率从45%显著提高到70%［1，18］。此外，越来越多的证据表明AKI 患者在长期可能发展成为CKD［5］。然而，迄今为止尚无有效的AKI 治疗策略，所有亟需我们进一步探索脓毒性AKI的发病机制，并研究新的预防和治疗措施。

Figure 3.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）aggravated the renal dysfunction and systemic inflammation of acute kidney injury mice induced by lipopolysaccharide（LPS）.A and B：the levels of renal injury biomarkers，blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（SCr）；C，D and E：the serum levels of inflammatory cytokines，IL-1β，IL-6 and tumor nwcrosis factor-α（TNF-α），were assessed by ELISA kits.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图3 IL-33预处理加重LPS诱导的AKI小鼠肾功能不全和全身炎症反应

Figure 4.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）aggravated the histopathological injury of kidney tissues induced by lipopolysaccharide（LPS）.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图4 IL-33预处理加重LPS所致肾组织病理损伤

IL-33，也被称为IL-1F11 和NF-HEV，于2005 年首次被确定为IL-1 家族的新成员［19-20］。与传统的细胞因子不同，IL-33 对炎症反应具有双重作用，这主要是由于IL-33 的不同存在形式（如细胞内核因子或细胞因子）［21］。当IL-33 作为细胞内核因子时，它可以隔离转录因子NF-κB，从而抑制NF-κB 表达，最终减轻炎症反应［22］。而作为细胞因子时，IL-33 可通过与ST2 受体结合来调节免疫应答。IL-33 和ST2 受体结合对不同T 细胞的分化和功能产生显著影响，尤其是调节2 型免疫应答。例如，IL-33 可以增加Th2免疫细胞的数量，并促进Th2 细胞的细胞因子或趋化因子的过度表达，如IL-13、IL-9 和IL-5［23］。IL-33还可以促进Th1 细胞和CD8+细胞毒性T 淋巴细胞的扩增，表现出抗病毒作用［24-25］。另据报道，IL-33 可通过增强炎症反应从而加重LPS 诱导的小鼠急性肺损伤［14］。而其他一些研究表明，IL-33 在某些炎症性疾病中具有保护作用［15］。因此，IL-33 的确切作用机制仍不明确。在本研究中，我们探讨了IL-33 对LPS 诱导的小鼠AKI的影响。

Figure 5.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）enhanced renal inflammation induced by lipopolysaccharide（LPS）.The protein expression of IL-1β，IL-6，tumor nwcrosis factor-α（TNF-α）and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（NLRP3）in kidney tissues was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图5 IL-33预处理能增强炎症反应，进一步加重LPS诱导的AKI

Figure 6.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）enhanced inflammation by expediting the activation of nuclear factor-κB（NF-κB）signaling pathway.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs lipopolysaccharide（LPS）group.图6 IL-33预处理通过进一步激活NF-κB信号通路增强炎症反应

在本研究中，我们探讨了IL-33 对LPS 刺激引起AKI 的影响，并进一步深入研究了其可能存在的分子机制。多项研究表明，IL-33 的表达与LPS 的刺激密切相关，我们的研究再次证实了IL-33 的表达与LPS 的刺激密切相关。我们构建了LPS 刺激诱导的AKI模型小鼠，以IL-33预处理后，血清BUN和SCr水平进一步升高，表明IL-33 能使LPS 所致AKI 的肾功能进一步受损。同时，IL-33 预处理后，血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎症因子水平也进一步增加，表明IL-33 能明显加重LPS 刺激引起全身炎症反应。HE染色结果显示，LPS刺激破坏了肾脏结构，肾组织出现水肿，而IL-33 预处理进一步增强了这种作用。我们还发现，IL-33 预处理显著加重了AKI 的炎症水平，表现为炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3的蛋白表达水平比单纯LPS 刺激增加更为显著。最后，我们研究了IL-33 在NF-κB 信号通路中的作用，结果表明，IL-33 预处理可进一步激活NF-κB 信号通路。所有这些数据表明，IL-33 可通过增强炎症反应加重LPS诱导的AKI，其分子机制可能是进一步激活了肾脏NF-kB信号通路。

综上所述，本研究发现IL-33 对LPS 诱导的AKI具有加重损伤的作用。进一步研究提示IL-33 能通过促进炎症反应加重LPS诱导的AKI，其分子机制可能是进一步促进了肾脏NF-kB 信号通路的激活。本研究提示IL-33 可能成为脓毒症所致AKI 或者其他肾脏炎性疾病的新干预靶点。