前列腺癌细胞核内雄激素受体靶基因的筛选

程玥 夏旭芬 陶志华

前列腺癌（prostate cancer,PC）是男性常见的一种恶性肿瘤[1]。近年来随着诊断技术的不断提高和生活方式的改变，PC发病率逐年升高[2-3]。早期PC表现为雄激素依赖性，因此通过手术或药物进行雄激素剥夺治疗是PC的标准治疗手段[4]。PC患者经雄激素剥夺治疗后会有一段缓解期，但是多数患者最终发展为雄激素非依赖性PC，且预后极差[5]。雄激素受体是核受体超家族的一员，通过与配体的结合诱导调节靶基因的表达，对PC的发生、发展具有重要作用[6]。在PC从雄激素依赖性发展为雄激素非依赖性的过程中，雄激素受体的靶基因也随之发生变化[7-8]。因此，本研究采用染色质免疫共沉淀技术联合高通量测序技术对雄激素依赖性PC和雄激素非依赖性PC的雄激素受体靶基因进行筛选，初步探索关键的雄激素受体靶基因。

1 材料和方法

1.1 细胞株 雄激素依赖性PC细胞株LNCaP购自中国科学院上海细胞库。依据慢性雄激素剥夺建立雄激素非依赖性PC细胞株，即将LNCaP细胞置于去雄激素的小牛血清培养液中长期传代培养，建立雄激素非依赖性PC细胞株LNCaP-AI[9-10]。

1.2 试剂和仪器 DMEM培养基、小牛血清均购自美国GIBCO公司；染色质免疫共沉淀试剂盒（含蛋白酶抑制剂、EZ-ZymeTMLysis Buffer、EZ-ZymeTMEnzymatic Cocktail、洗脱缓冲液）购自美国Millipore公司；RTPCR试剂盒SYBR Green Master Mix购自瑞士Roche公司。CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司；RT-PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 LNCaP细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中，LNCaP-AI细胞培养于含10%小牛血清无酚红DMEM培养基中；均置于含5% CO2的37℃恒温饱和湿度培养箱中培养。

1.3.2 细胞染色质免疫共沉淀 LNCaP细胞培养瓶和LNCaP-AI细胞培养瓶中分别加入1%甲醛5 min，使DNA-蛋白的相互结合作用被交联固定。交联后的细胞用PBS清洗3次，再加入含蛋白酶抑制剂的PBS，使用细胞刮刀将LNCaP、LNCaP-AI细胞分别收集于不同EP管中，离心，去上清液，留细胞团。使用EZ-ZymeTMLysis Buffer 400 μl重悬收集的细胞团，将重悬液置于冰上反应0.5 h。将EP管放入液氮中，待完全结冰后置于37℃水浴箱内直到解冻，此过程重复4～5次，以充分裂解LNCaP、LNCaP-AI细胞。在EP管中加入15 μl EZ-ZymeTMEnzymatic Cocktail，37 ℃反应0.5 h；打断基因组DNA至100～500 bp大小。分别在LNCaP、LN‐CaP-AI细胞裂解液中加入10 μl抗AR抗体和50 μl磁珠轻轻混匀，4℃振荡孵育过夜。将获得的免疫沉淀复合物用洗脱缓冲液洗脱并解交联，得到染色质免疫共沉淀下的DNA。

1.3.3 高通量测序 将染色质免疫共沉淀下的DNA片段进行末端修复，3'端加A碱基，连接测序接头，使用Illumina进行测序。测序完成后的原始数据进行去测序接头等处理，去除掉不合格的序列，最终获得可用的数据。将此测序数据与人类基因组19进行比对，其中比对到人类基因组19上唯一位置且不超过2个碱基错配的序列用于后续分析。分析其在参考基因组上的覆盖分布，统计基因组位点的深度信息，得到基因组上测序深度统计结果。

1.3.4 基因表达水平检测 采用RT-PCR法。使用Trizol法提取细胞总RNA，通过OD260/OD280比值鉴定RNA质量和纯度，选择比值为1.8～2.0的样品并计算其浓度。按RT-PCR试剂盒说明书进行反应，合成cDNA模板并进行PCR扩增，PCR条件：95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共50个循环。基因引物序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy‐drogenase,GAPDH）为内参，采用 2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

表1 引物序列

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高通量测序结果 LNCaP细胞中发现9 021个基因组测序数据富集区域，其中4 143个落在雄激素受体结合位点，将这些位点定位到基因组后得到2 796个雄激素受体相关基因。LNCaP-AI细胞中发现4 949个基因组测序数据富集区域，其中2 380个落在雄激素受体结合位点，将这些位点定位到基因组后得到1 854个雄激素受体相关基因（与LNCaP细胞中得到的雄激素受体相关基因相同的有789个）。对两种细胞株的2 796、1 854个雄激素受体相关基因分别进行生物学信号通路分析，结果显示多数靶基因集中在肌动蛋白细胞骨架的调节、紧密连接、血管平滑肌收缩信号通路；LNCaP与LNCaP-AI细胞的差异靶细胞通路为黏着斑，见表2～3。

表2 2 796个LNCaP细胞雄激素受体相关基因主要信号通路的基因量[个（%）]

表3 1 854个LNCaP-AI细胞雄激素受体相关基因主要信号通路的基因量[个（%）]

2.2 雄激素受体差异靶基因表达情况 从LNCaP与LNCaP-AI细胞测序得到的雄激素受体差异靶基因中筛选出富集程度较高的雄激素受体差异靶基因2个，即LIFR、PSMA6。与LNCaP细胞比较，LNCaP-AI细胞中LIFR、PSMA6 mRNA表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。

图1 LNCaP与LNCaP-AI细胞中LIFR、PSMA6 mRNA表达水平比较（a：LIFR；b：PSMA6）

3 讨论

雄激素受体作为核受体，在PC从雄激素依赖性发展为雄激素非依赖性的过程中起着重要作用，但是具体机制尚未完全明确。本实验采用染色质免疫共沉淀技术联合高通量测序技术对LNCaP、LNCaP-AI细胞中雄激素受体靶基因进行筛选，结果发现在雄激素依赖性PC与雄激素非依赖性PC的雄激素受体靶基因存在差异。在LNCaP细胞中发现2 796个雄激素受体相关基因，LNCaP-AI细胞中发现1 854个雄激素受体相关基因，其中有789个是相同的。分别对2 796、1 854个雄激素受体相关基因进行生物学信号通路分析，结果发现LNCaP与LNCaP-AI细胞的差异靶细胞通路为黏着斑。本研究进一步从LNCaP与LNCaP-AI细胞测序得到的雄激素受体差异靶基因中筛选出富集程度较高的雄激素受体差异靶基因2个，即LIFR、PSMA6；同时对LNCaP、LNCaP-AI细胞中LIFR、PSMA6 mRNA表达水平进行检测与比较，结果发现LNCaP-AI细胞中LIFR、PSMA6 mRNA表达水平均明显高于LNCaP细胞。Chen等[11]发现LIFR在乳腺癌组织中表达失调，可能与乳腺癌的发生、发展密切相关。Wu等[12]认为LI‐FR表达可能为恶性肿瘤的诊断与治疗提供参考。Kakumu等[13]认为PSMA6沉默可以诱导肺癌细胞凋亡。Zhang等[14]发现PSMA6表达升高在肺腺癌的发生发、展中起一定作用。Yang等[15]研究表明，PSMA6在晚期转移性胃癌患者中呈高表达。

综上所示，LIFR、PSMA6为PC细胞核内雄激素受体靶基因，这为进一步探索PC雄激素受体靶基因的功能提供了理论基础，为PC治疗提供新的靶点。