非洲猪瘟病毒调控宿主天然免疫应答机制研究进展

何文瑞，杨中元，韩世充，万博，张改平

(河南农业大学动物医学院 国家动物免疫学国际联合研究中心，河南 郑州 450046)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高度接触性、致死性猪传染病，以高热、黏膜和淋巴结出血以及腹痛腹泻为主要特征[1]。该病最早在1921年出现于非洲肯尼亚，临床症状与猪瘟相似，因此被称作非洲猪瘟。20世纪中期，ASF蔓延至欧洲、美洲等地区。2018年8月，ASF疫情首次在中国辽宁被报道，随后在全国多个省市暴发，给生猪产业的发展带来空前威胁。然而，针对ASF，目前国内外尚无有效的疫苗和治疗手段。对于ASF的防控已经成为中国亟待解决的重大战略需求[2]。对ASFV感染诱导宿主免疫应答机制认知的局限性阻碍了安全有效的ASF疫苗的开发。ASFV感染宿主机制及其与机体免疫系统相互利用和制衡的关系直接影响了ASF疫苗的研制策略。

针对ASF新型基因工程疫苗的研究工作已经开始，包括重组减毒活疫苗和病毒活载体疫苗的研制等。MONTEAGUDO等[3]研究发现，CD2样蛋白(CD2-likeprotein，CD2v)相关基因缺失的减毒活疫苗BA71毒株可以对其同源强毒株和不同基因型毒株产生一定保护效果。步志高团队构建的七基因缺失减毒活疫苗HLJ/1-7GD在早期临床试验中表现出较好的免疫保护效果，目前正在进行转基因兽用微生物安全评价生产性试验[4]。2020年初，中国国内出现“野疫苗毒”相关感染病例。该类病例感染症状不明显，样品中病毒含量低，导致非自然ASFV基因缺失毒株成为中国非洲猪瘟防控中所面临的新污染源和传染源，大大增加了中国非洲猪瘟疫情防控的复杂性[5]。病毒感染宿主的过程也是病毒与宿主相博弈的过程，逃逸宿主的免疫监视是病毒成功感染的前提。天然免疫是机体抵抗病毒入侵的第一道防线。干扰素(interferon,IFN)免疫应答、炎症反应和细胞凋亡是抗病毒天然免疫应答的重要组成部分，这些过程在ASFV感染和致病过程中发挥重要作用，相关的病毒蛋白亦是ASFV新型疫苗研究的重要分子靶标。因此，尽快阐明ASFV的免疫逃逸机制，对于快速高效研制ASF疫苗十分重要。

1 ASFV的分子生物学特征

ASFV为非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)成员。与其他核质巨DNA病毒相似，ASFV结构复杂，基因组全长170～194 kb，包含151～167个开放阅读框，编码参与病毒基因组复制、DNA修复、转录、病毒组装及逃逸宿主天然免疫机制和调控适应性免疫等过程的诸多蛋白[6]。成熟的ASFV病毒粒子呈二十面体对称结构，直径260～300 nm。病毒粒子核心是由病毒基因组和部分蛋白形成的类核，向外依次为厚厚的蛋白质层(核心层)、含基质蛋白的内囊膜层、二十面体蛋白衣壳层及出芽时由细胞质膜获得的外囊膜层[1,7-8]。研究表明，ASFV主要感染猪单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞等。病毒经网格蛋白介导的内吞途径或巨胞饮途径入侵细胞后，进入内体并脱去外壳，随后病毒内膜与内体膜融合，病毒核心壳成功从内体逃逸并进入胞质[9-10]。ASFV核心壳经细胞的微管系统迁移至核周微管组织中心，释放出病毒核酸，开始病毒的复制，包括蛋白翻译、DNA复制和病毒颗粒组装等[11-12]。

目前，已证实p72、p54、p30和CD2v等蛋白是ASFV重要的免疫原。体外表达的CD2v蛋白接种动物，能够对同源ASFV强毒株感染提供部分免疫保护。p30蛋白、p54蛋白和p72蛋白能够诱导猪体产生中和抗体，但并不能起到很好的免疫保护效果。缺失DP71L、DP96R、B119L或DP148R基因能显著减弱病毒毒力，也能对同源亲本强毒株感染起到一定的保护性效果[13-14]。因此，阐明ASFV众多编码蛋白的生物学功能，重点解析负责在猪体内完成免疫逃逸病毒蛋白的作用机制迫在眉睫，这将为安全高效新型疫苗的开发指明方向并提供强有力的理论依据。

2 ASFV对天然免疫应答的调控

天然免疫系统是哺乳动物抵抗入侵病原微生物的第一道防线。研究表明，宿主通过初步识别保守的病原微生物结构，即病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)诱导下游效应因子IFN和炎症因子等的表达[15]。这些细胞因子能促进抗原提呈细胞(例如树突状细胞)的成熟和活化，并由此激活适应性免疫应答以完全清除病原体和建立免疫记忆。哺乳动物细胞的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)主要识别细胞外和细胞内病原微生物复制过程中产生的微生物成分和中间代谢产物(例如病毒核酸、细菌脂多糖和鞭毛)，以及细胞自身异常定位的核酸(例如线粒体DNA)进而激活天然免疫应答。不同类型的PRR构象结构不相似，氨基酸序列不保守，其亚细胞定位亦存在差异。PRR的这些特征保障细胞及时有效感知各种来自细胞内外的压力和有害信号。PRR识别微生物PAMPs后启动涉及接头蛋白和激酶以及转录因子的信号传导，进而诱导下游效应基因的表达和天然免疫应答的激活[16-17]。

然而，面对机体如此完备的免疫系统，ASFV仍旧存在并肆虐全球，严重威胁着包括中国在内的全球养猪业的健康发展。这表明ASFV在与宿主相互利用、相互制衡的过程中已经进化形成了一套完备的免疫逃逸策略，以保证其在宿主体内能够很好地完成复制并成功感染新的宿主。ASFV庞大的基因组为其有效复制及复杂的免疫逃逸特性提供了物质基础。目前，国内外研究已初步揭示了少数ASFV编码蛋白在调控宿主天然免疫应答中的关键功能和作用机制，包括IFN信号通路、炎症反应和细胞凋亡过程，为ASF的防治提供一定的理论依据。

2.1 ASFV对IFN信号通路的调控

ASFV是大型双链DNA病毒，感染细胞后主要被胞质DNA识别受体环二腺苷酸合成酶cGAS所识别。在未感染细胞中，cGAS以单体形式存在于胞浆中，没有DNA结合或酶促活性。在识别并结合DNA后，cGAS发生去谷氨酰化和类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化以实现最佳活化[18-19]，随后活化的cGAS以GTP和ATP为底物催化合成cGAMP，新合成的第二信使cGAMP与STING蛋白结合。STING蛋白结合cGAMP后发生寡聚化，形成活化的MITA蛋白并与iRhom2结合，然后易位至ER-Golgi中间区室(ERGIC)。在ERGIC、TBK1和IRF3被招募到MITA蛋白相关复合体后，磷酸化的IRF3发生二聚化并入核，启动下游效应基因的转录。随后，MITA蛋白进一步易位至核周点状结构或微粒体，发生溶酶体依赖途径的降解以终止天然免疫应答[17,20]。

细胞产生的I型IFN分泌到细胞外，被细胞表面的IFN受体复合物IFNAR1/IFNAR2异源二聚体所识别。IFNAR1/IFNAR2结合I型IFN后，其胞内端分别招募酪氨酸激酶TYK2或JAK1，相互靠近的TYK2和JAK1彼此磷酸化。活化的TYK2和JAK1分别招募并磷酸化STAT2或STAT1，诱导STAT1、STAT2与IRF9形成异源三聚体IFN刺激基因因子3(ISGF3)[21]。随后ISGF3入核，与IFN刺激反应元件(ISREs)结合，启动ISGs的转录[22]。许多ISGs通过直接靶向病毒感染和复制的不同环节，限制病毒扩散，从而有效清除入侵的病毒[23]。

RIERA等[24]研究发现，不论是ASFV强毒株(Arm/07/CBM/c2)还是弱毒株(NH/P68)感染，均能通过靶向JAK/STAT信号通路抑制IFN所诱导的下游ISGs的表达。病毒感染除了能阻断ISGF3复合物的核易位，还能诱导STAT1和STAT2分别发生caspase 3或蛋白酶体依赖的降解。这充分表明了IFN信号通路在ASFV成功复制过程中的重要性。上述研究表明，I型IFN信号通路的激活和ISGs的产生是宿主抵抗病毒感染所必须的，而ASFV抑制IFN和下游ISGs的表达并成功逃逸该通路是病毒成功感染和致病的关键。

2.1.1 ASFV的MGF家族蛋白对IFN信号通路的调控 研究显示，IFN处理能显著抑制细胞水平和猪体水平ASFV的复制，这不但为ASF防治提供了新的策略，也表明IFN信号通路在ASFV感染和致病过程中的关键作用[25]。ASFV基因组结构分为左右两侧可变区和中央保守区，而位于可变区的多基因家族蛋白主要分为5种，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505/530。与痘病毒类似，这些可变区基因家族蛋白并非病毒体外增殖所必须的，但参与抑制宿主I型IFN产生和调控炎症因子表达等过程[13]。MGF360和MGF530/505家族蛋白能抑制干扰素表达，缺失毒株基因能诱导更高水平的免疫应答，是目前构建基因缺失疫苗的主要靶基因。

研究显示，与亲本毒株相比，缺失MGF360或MGF505家族部分基因的致弱株OURT88/3和适应组织细胞的BA71V毒株，可导致I型干扰素表达水平升高，表明MGF360和MGF505蛋白具有抑制干扰素表达的功能。与亲本野生毒株相比，MGF360或MGF505家族部分基因缺失的突变株在巨噬细胞中复制效率无明显差异，但毒力明显下降，能提供一定程度的免疫保护能力[26-27]。GARCA-BELMONTE等[28]研究表明，ASFV减毒株NH/P68在感染早期即可被cGAS识别，诱导cGAMP合成以及随后STING的激活及迁移，并经TBK1-IRF3信号轴激活宿主抗病毒天然免疫应答，诱导I型IFN的水平表达。然而，ASFV强毒株Armenia/07感染细胞时，则会显著抑制cGAS-cGAMP诱导的STING蛋白活化，以及随后抗病毒蛋白的转录和表达，且IFN和ISGs的表达水平甚至低于未处理细胞。

除了不同毒株表现出对IFN调控的差异外，ASFV的MGF家族多个基因也可通过作用于不同靶点来调控IFN的产生。MGF360家族12L蛋白MGF360-12L能显著抑制IFN-β启动子激活以及下游抗病毒基因的转录。研究结果显示，MGF360-12L一方面可能通过经典核定位信号介导的过程抑制p50蛋白和p65蛋白的核定位，另一方面通过与核转运蛋白KPNA2、KPNA3和KPNA4结合，竞争性阻断其与p65蛋白之间的相互作用，进而抑制NF-κB核易位以及随后I型IFN的产生，从而逃逸宿主的免疫监视[29]。MGF360家族成员A276R通过靶向IRF3抑制I型IFN的表达，该抑制过程并不依赖于IRF7和NF-B，其具体调控机制尚不清楚[30]。

郑海学研究团队的LI等[31]发现，多个调控宿主IFN信号通路激活的MGF家族蛋白，并通过构建缺失毒株对这些功能基因在病毒水平的功能进行了探究。MGF505-7R与STING蛋白存在相互作用，并能通过促进自噬相关蛋白ULK1的表达降解STING蛋白，负调控STING蛋白依赖的抗病毒天然免疫应答，抑制I型IFN的产生，帮助病毒实现免疫逃逸[31]。此外，MGF505-7R还能通过上调E3泛素连接酶RNF125的表达，促进JAK1和JAK2的降解，抑制IFN诱导的JAK-STAT1信号通路激活[32]。与野生型ASFV相比，MGF-505-7R缺陷型ASFV在原代猪肺泡巨噬细胞和猪中均诱导更高水平的IRF1表达，并且病毒复制能力、毒力和致病力均有所减弱。MGF360-9L与STAT1和STAT2存在相互作用，并通过诱导这二者的泛素-蛋白酶体途径降解，抑制IFN信号通路的激活。ASFV-Δ360-9L毒力部分减弱，表明MGF360-9L是ASFV的关键毒力因素[33]。

翁长江研究团队的LI等[34]发现，与其亲本毒株ASFV HLJ/18相比，MGF505-7R缺陷型毒株ASFV-Δ7R毒力明显降低，且能更好诱导细胞和猪体内IFN-β的表达。过表达MGF505-7R能显著抑制IFN-β的产生，一方面MGF505-7R通过抑制IRF3的核转位，同时MGF505-7R与IKK复合物中的IKKα相互作用以抑制NF-κB活化，进而调控病毒诱导的I型IFN产生。

YANG等[35]研究发现，MGF505-11R通过与STING蛋白相互作用，经溶酶体、泛素-蛋白酶体和自噬途径诱导STING蛋白降解，进而负调控cGAS-STING信号通路，抑制I型IFN和ISGs的表达。此外该团队还发现，MGF360-11L经半胱氨酸、泛素-蛋白酶体和自噬途径降解TBK1和IRF7，进而抑制IFN信号通路的激活，但其研究并未在病毒和个体水平对这2个蛋白的功能进行验证[36]。

综上可知，缺失MGF家族蛋白能够有效减弱病毒毒力，接种该类缺失毒株对部分强毒株感染具有一定的免疫保护效果，但却不足以对易感猪群提供完全保护。因此，除MGF家族蛋白成员外，ASFV编码的其他众多蛋白在病毒免疫逃逸过程中也发挥着重要作用。探索和解析ASFV其他病毒蛋白的生物学功能，是构建新型高效疫苗所必须的。

2.1.2 ASFV结构蛋白对IFN信号通路的调控 研究表明，除MGF家族成员外，ASFV结构蛋白在IFN信号通路调控过程中也发挥着重要作用。CHAULAGAIN等[37]研究发现，在PK15细胞或ASFV主要靶细胞(猪外周血单核淋巴细胞和巨噬细胞)中，过表达CD2v蛋白能显著诱导NF-κB依赖的IFN-β表达和下游抗病毒基因ISGs的转录。CD2v抗体或NF-κB抑制剂处理能明显抵消细胞中CD2v诱导的NF-κB活化和IFN-β表达。这表明ASFV感染时经其结构蛋白CD2v激活NF-κB，从而诱导猪淋巴细胞/巨噬细胞中的IFN信号通路的激活。

LIU等[38]研究发现，ASFV衣壳蛋白E120R参与ASFV免疫逃逸过程的调控。该研究结果表明，E120R通过其72～73位氨基酸与IRF3相互作用，阻碍TBK1对IRF3的招募，以及随后IRF3磷酸化，抑制IFN信号通路激活。与亲本野生毒株相比，ASFV的E120R中72～73位氨基酸缺失毒株能诱导更高水平的IFN表达，其安全性和有效性也得到了明显提高。此外，该研究还发现ASFV核心壳蛋白S273R也参与调控IFN和ISGs的表达。FoxJ1具有良好的抗病毒效果，一方面FoxJ1能通过自噬途径降解ASFV MGF505-2R和E165R蛋白，此外也可通过增强IFN信号通路激活表现出良好的抑制ASFV复制效果。ASFV半胱氨酸蛋白酶S273R能抑制抗病毒蛋白FoxJ1的表达，从而削弱机体的抗病毒反应[39]。

除病毒结构蛋白外，目前研究还发现，ASFV早期转录基因DP96R以及晚期转录基因E2泛素结合酶基因I215L、A137R均可通过靶向TBK1抑制I型IFN的产生[40-42]。上述研究均证明，ASFV对IFN产生的拮抗能力与其致病性密切相关，而深入探究和完善ASFV调控干扰素信号通路的知识图谱，则将为ASF新型高效疫苗的研发提供强有力的理论支撑。例如目前研究较为透彻，在ASFV的毒力和ASF的发病机制中起关键作用的MGF-505-7R、E120R等就有望成为开发ASFV减毒疫苗的新的分子靶标。

2.2 ASFV对NF-κB信号通路的调控

天然免疫系统的PRRs感知入侵的病毒被激活后，除诱导产生I型IFNs外，也能通过促炎性细胞因子(例如TNF和IL-1β)的分泌进一步激活NF-κB并诱导炎症因子的表达，促进炎症反应的发生，从而抵抗病毒的入侵和复制。此外，天然免疫系统还能通过激活NLRP3炎症小体途径，促进炎症因子的分泌。炎症反应是天然免疫应答的重要组成部分，与病毒感染后的发病进程和致病力密切相关。ASFV感染猪只后，能显著诱导血清中炎症因子的表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8[43]。研究再次表明，ASFV感染细胞能引起宿主明显的炎症反应，细胞内诱导合成的TNF-α是ASFV诱导细胞凋亡的主要因素，这表明炎症反应在ASFV致病过程中发挥重要作用[44]。

IκB激酶(IKK)复合物是经典炎症通路的重要组成部分。LI等[34]发现，ASFV感染诱导IL-1β的产生依赖于TLRs/NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体，MGF505-7R与IKK复合物中的IKKα相互作用以抑制NF-κB活化并与NLRP3结合以抑制炎症小体形成，导致IL-1β产生减少。YANG等[45]发现，ASFV的F317L可与IKK复合物中的IKKβ相互作用，抑制其磷酸化，并增强下游NF-κB复合体抑制物因子IκBα的稳定性，抑制IκBα的磷酸化，阻断了NF-κB的活化，继而调控宿主炎症反应。与此同时，过表达F317L可增强ASFV的复制，反之可抑制病毒复制，而缺失F317L则不能成功拯救出病毒，这表明炎症调控因子F317L对ASFV的复制至关重要。

ZHOU等[46]研究发现，ASFV衣壳蛋白H240R参与调控病毒感染引起的炎症反应。与亲本野生毒株相比，由于不能有效形成感染性颗粒，H240R缺失毒存在明显的生长缺陷，但该缺失毒株可诱导PAM细胞中更高水平的炎性细胞因子表达。这表明H240R可能在拮抗宿主炎症反应过程中发挥一定作用。然而，作为NF-κB抑制因子IκB同系物，ASFV早期蛋白A238L虽能在细胞水平抑制NF-κB的活化并调控相关炎症因子的表达，但体内外研究结果均显示A238L缺失毒株和亲本毒株在生长特性、毒力和致病力方面均无显著差异[47-48]。

综上所述，缺失单个调控宿主炎症反应的ASFV蛋白很难在病毒水平表现出对感染与致病能力的影响，这表明ASFV编码多个相互协调或制衡的调控炎症反应的蛋白。因此，全面解析ASFV调控宿主炎症反应的分子机制，将有助于客观真实理解ASFV感染与致病机制，为ASF新型疫苗和诊疗手段的研制提供理论依据。

2.3 ASFV对凋亡过程的调控

细胞凋亡即细胞程序性死亡，是一种应激性细胞行为，是宿主抗病毒免疫应答的重要部分，参与病毒与宿主的博弈过程。ASFV感染宿主细胞过程中，可通过对细胞凋亡等细胞生物学行为的调控来逃逸宿主的免疫监视，维持或促进自身的存活和增殖。在感染早期，细胞凋亡的发生不利于病毒的感染和复制；在感染晚期，病毒粒子大量组装复制，需借助细胞凋亡完成病毒颗粒的释放和扩散。因此，ASFV通过编码多种凋亡调控蛋白，一方面保证病毒的成功侵袭，另一方面在病毒大量复制完成后加速细胞凋亡，实现病毒的传播。

2.3.1 ASFV的p54蛋白诱导细胞凋亡 p54蛋白由ASFV的E183L基因编码，是病毒的结构蛋白，定位于内囊膜[8]。该蛋白参与吸附宿主细胞[49]以及病毒粒子组装(内质网膜转化为病毒内囊膜)[50]的过程。ALONSO等[51]研究发现，ASFV能通过病毒蛋白p54蛋白与细胞动力蛋白LC8的轻链直接结合，劫持微管运动复合体细胞转运系统，实现病毒内化及向细胞内病毒复制工厂的转运。包含SQT基序的13个氨基酸结构域(149～161个氨基酸位置)对p54蛋白与LC8的结合至关重要，这些氨基酸序列与仅表达BH3的促凋亡蛋白的Bim结构域具有一定相似性。HERNEZ等[52]研究结果表明，在ASFV感染的早期阶段，病毒激活caspase-9和caspase-3，诱导细胞凋亡的启动。过表达p54蛋白能够显著诱导caspase-3的激活和细胞凋亡的发生。这13个氨基酸结构域缺失p54蛋白突变体不仅丧失了与LC8的结合能力，同样失去了激活caspase-3和细胞凋亡的能力。

2.3.2 ASFV蛋白对细胞凋亡的抑制作用 NEILAN等[53]研究发现，ASFV复制晚期蛋白A224L在不同毒株中序列较为保守，包含单个BIR基序(杆状病毒重复结构)，是细胞凋亡抑制蛋白家族的成员。然而与亲本野生毒株相比，感染猪巨噬细胞后A224L缺失病毒在生长特性、存活时间以及毒力方面均无显著差异，被感染细胞凋亡的发生和严重程度亦无明显区别。随后，NOGAL等[54]对A224L的功能进行了进一步探讨，发现不论是稳定转染还是ASFV感染情况下，A224L均表现出抗凋亡功能，该蛋白可能通过与caspase-3的蛋白水解片段相互作用抑制该蛋白酶的活性，以及随后的细胞凋亡。此外，RODRGUEZ等[55]研究则表明，A224L能够通过IKK激活转录因子NF-κB，抑制细胞凋亡。综合以上研究结果，凋亡抑制蛋白A224L可能在病毒粒子早期入侵或感染晚期发挥作用，缺失该基因病毒并未诱导细胞产生更强的凋亡，推测是病毒其他凋亡抑制蛋白的补偿功能造成的[56]。

C型凝集素类似蛋白EP153R是ASFV复制增殖的非必需蛋白，在病毒感染的早期和晚期均有表达，除参与病毒感染后的血细胞吸附过程外，还参与caspase-3的表达以及细胞凋亡的调控过程。过表达EP153R能部分保护转染细胞系免受病毒感染或外部刺激引起的细胞凋亡。p53蛋白参与许多凋亡抑制分子的转录调控，过表达EP153R能抑制病毒感染或星形孢菌素处理条件下p53蛋白的反式激活活性，进而调控细胞凋亡的发生[57]。

Bcl-2类似蛋白A179L蛋白在ASFV感染早期和晚期均有表达，主要定位在线粒体或内质网。不同的毒株中该基因序列高度保守，在多种不同细胞系例如HeLa、BSC-40和K562细胞中过表达A179L均能抑制细胞凋亡[58-60]。BRUN等[59]通过重组杆状病毒在昆虫细胞中过表达A179L，显著延长了单层生长的被感染细胞的存活时间，这表明A179L的抗凋亡活性可能依赖于细胞锚定。结构生物学研究结果显示，A179L几乎能与哺乳动物所有Bcl-2家族促凋亡蛋白结合，既能通过与促凋亡蛋白Bid的活性截短体p13和p15相互作用，抑制其活性，也能通过直接与促凋亡蛋白家族的其他成员如Bak和Bax等结合，抑制细胞凋亡[59]。除了在细胞凋亡中的作用外，A179L还能通过其BH3同源结构域与Beclin-1在线粒体和内质网相互作用，在饥饿条件下抑制自噬体的形成，这可能是为了避免溶酶体融合对复制或新组装病毒粒子的降解[60]。

GALINDO等[61]研究表明，内质网是ASFV复制的重要场所，当内质网积累过量的未折叠蛋白或错误折叠蛋白时，会导致内质网应激(即未折叠蛋白反应，UPR)。ASFV感染能够选择性活化ATF6信号通路，激活caspase-12，诱导分子伴侣钙联蛋白和钙网状蛋白表达，以改善内质网的应激状态，抑制早期细胞凋亡并确保病毒复制顺利完成。ASFV的DP71L蛋白是单纯疱疹病毒ICP34.5蛋白和细胞GADD34蛋白的类似物，在不同毒株中序列相对保守。RIVERA等[62]通过酵母双杂交试验筛选发现，DP71L与蛋白磷酸酶PP1之间存在相互作用，并能够激活PP1。随后，DIXON研究团队通过多项研究进一步证实，与ICP34.5蛋白相似，DP71L能通过与PP1催化亚基的结合，招募真核翻译起始因子2α(eIF2α)，引起静息状态或内质网应激状态下eIF2α的去磷酸化，以及ATF4及其下游促凋亡因子CHOP的产生，从而阻止内质网应激过度导致的细胞凋亡，以促进病毒增殖[7,56,58]。然而与亲本野生毒株相比，DP71L、缺失毒株感染并没有显著影响细胞中eIF2α的磷酸化水平以及CHOP产生，表明DP71L不是ASFV感染过程中调控该过程的唯一因素，ASFV存在其他机制来调控eIF2磷酸化以及随后的蛋白质合成[63-64]。

ASFV编码多种调控细胞凋亡的蛋白，例如p54蛋白、A224L蛋白和DP71L蛋白等。但目前的研究仅发现ASFV结构蛋白p54促进病毒感染早期细胞凋亡的发生，其余蛋白均为细胞凋亡抑制因子，推测其目的主要是促进ASFV感染靶细胞的存活，保障病毒感染、增殖和免疫逃逸。但ASFV如何调控诸多凋亡调控蛋白的表达时间和表达水平，以及如何平衡细胞凋亡促进蛋白与抗凋亡蛋白之间的功能，从而保证病毒有效复制、成功释放并扩大感染仍是今后研究中的重点。

3 展望

疫苗是防控动物病毒病的首要工具，ASF康复猪可以产生对该病的免疫力，为ASF疫苗的研发提供了理论可能。从灭活病毒、重组亚单位疫苗、DNA疫苗再到减毒活疫苗，全球科研工作者从多种途径寻求ASF疫苗研发的突破口，但截至目前仍没有一种有效、安全的ASFV疫苗上市。在没有疫苗有效激活特异性免疫应答的情况下，全面了解ASFV利用自身复杂分子生物学结构突破机体天然免疫防线的分子机制具有重要意义。

天然免疫是机体识别和抵抗病毒感染的第一道防线，具有反应快速、非特异、普遍性和多样性等特点。天然免疫细胞能通过鉴别杀伤被ASFV感染的靶细胞，同时激活补体通路，非特异性清除血液和淋巴结中的病毒。IFN的产生是机体在ASFV感染早期阻止病毒快速繁殖、扩散的重要武器，同时伴随发生的炎症反应也是机体清除入侵病毒的重要组成部分。然而大量研究表明，ASFV感染能显著降低宿主抗病毒天然免疫水平，进而抑制免疫级联反应过程下游特异性免疫的激活。

ASFV基因组编码近200种蛋白。已有研究表明，ASFV感染过程中，A238L、DP96R、MGF360、MGF505和A276R等多种蛋白参与调控了天然免疫信号转导，促进病毒的感染，逃逸宿主免疫应答。但是，对于庞大的ASFV蛋白体系来说无疑是杯水车薪。天然免疫处于机体抗病毒感染的前线，其作用的正常发挥不但有效抑制了病毒的入侵，还搭建了激活特异性细胞免疫和体液免疫的桥梁。因此，全面阐明ASFV调控天然免疫应答和病毒感染致病过程之间的微妙平衡，是研发安全有效ASF疫苗的重要理论基础。本研究团队也系统开展了ASFV免疫逃逸相关研究，通过构建病毒的表达克隆，借助双荧光素酶报告基因试验对调控IFN信号通路、经典NF-κB信号通路以及宿主表达翻译等重要过程的病毒蛋白进行了筛选，并正在开展数十个候选蛋白的功能鉴定和机制探究(相关研究结果尚未发表)。这些研究工作的完善将为ASFV感染与致病机制的阐明提供强有效的理论支持。