水稻糙米率QTL检测及候选基因分析*

芦 涛， 叶涵斐， 褚晓洁， 林 晗， 王 盛，潘晨阳， 李三峰， 王跃星， 饶玉春

(1．浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2．中国水稻研究所，浙江 杭州 311121)

水稻(OryzasativaL.)是世界上主要的粮食作物，加工品质作为水稻的重要品质之一，在改善水稻品质和提高水稻产量方面发挥了极为重要的作用[1]．随着现代生活水平的提高，稻米品质越来越受到消费者的重视，培育出高加工品质的稻米对于农业和经济发展具有重要的作用．

水稻的糙米率受多种因素共同影响，由多个基因共同调控的数量性状，其相关分子机制复杂，并受到环境因素调控[2]．目前已经有80余个水稻糙米率QTL被报道，穆平等[3]利用IRAT109/越富构建的DH群体定位到1个控制糙米率的主效QTL．刘家富等[4]以特青/云南野生稻构建了一套深入系，并定位到3个与糙米率相关的QTL，同时发现第1染色体RM449～RM3120区间内存在着1个QTL，其同时影响了水稻的糙米率和精米率．张上都等[5]通过V20B/CPSLO17构建的RILs群体在1号染色体上发现1个糙米率QTL，位于Marker641882～Marker738688，LOD值为3.267．周勇等[6]利用广陆矮4号/日本晴衍生的RILs群体定位到3个关于糙米率的QTL，其中1个位于第6染色体，2个位于第9染色体．饶玉春[7]利用DH群体检测到4个跟糙米率有关的QTL，分别在第1，8，9，10染色体上．这4个QTL当中位于第10染色体的RM271～RM304区间内的QTL位点，其LOD值高达3.95．近年来已报道许多关于水稻品质的位点：gw9.1来自于野生稻的基因组，被定位在第9号染色体上[8]，而其等位基因可以增加籽粒的质量；TGW3编码1个类似糖原合酶激酶GSK3的激酶，可以负调控籽粒的长度和质量，同时也可以改变籽粒外壳当中细胞的大小和数量[9]；GS2在水稻内作为转录因子发挥作用，当过量表达GS2时可以引起籽粒中细胞增大增多，进而提高产量[10]．

虽然前人的研究已经发现了一部分糙米率相关QTL，但是目前并没有成功克隆出与糙米率相关的基因[11]，因此,水稻糙米率具有巨大的研究价值．同时有研究表明，不同的定位群体检测到的糙米率QTL之间也具有差异，挖掘不同材料中的糙米率QTL对深入研究糙米率的遗传机制具有重要的意义．HZ具有稳产、高产、品种多等优点，Nekken是日本在20世纪90年代选育的一份粳型常规水稻品种，具有广谱亲和性与较强的亲和力，被广泛应用于亲和研究和育种利用．本研究以典型籼粳交(HZ/Nekken)构建的重组自交系群体(RILs)为材料，对水稻糙米率进行QTL定位，同时还进行了复合QTL模型分析，以期发现更多有价值的QTL位点，为培育高品质、高产的水稻品种奠定基础．

1 实验材料

本实验以Nekken为母本、HZ为父本进行杂交，以F1代通过单粒传法套袋自交，从而获得120个稳定遗传的重组自交系，组成RILs群体(见图1)．

图1 亲本与RILs群体的构建原理图

2 实验方法

2.1 水稻催芽与田间管理

每个重组自交系分别取50粒种子，用70%酒精冲洗2～3次，每次2 min，再用10%次氯酸钠消毒2 min，最后用去离子水反复清洗种子10 min，洗去消毒液．随后将消毒完成的种子浸入水中2 d，2 d后用湿透的纱布包裹种子，放入37 ℃的培养箱进行催芽并保持毛巾湿润．等到种子普遍露白时，挑选长势基本相同的幼芽播种到田中．等幼芽生长1个月之后，再从每个重组自交系挑选24株生长状况相同的水稻苗进行移苗，每个株系按照4行6列移植．期间定期除草杀虫，保证水稻苗的正常生长．

2.2 糙米率数据测定

待水稻成熟后每个株系随机采收10株混合收种，脱粒后放入烘箱干燥，等到完全干燥后将种子放置储藏柜室温储藏3个月．糙米率测定方法参考《粮食、油料检验稻谷出糙率检验法》(GB/T 5495—2008)[12]．每个自交系称出100 g饱满、没有病态的谷子，然后去壳，称出糙米的质量，用糙米的质量比上谷子的质量就是糙米率．

m=m1/(m2-m3)×100%.

其中：m代表糙米率(%)；m1代表糙米质量(g)；m2代表试样谷质量(g)；m3代表脱壳谷质量(g)．

2.3 遗传图谱的构建

使用CTAB法提取Nekken、HZ和120个重组自交系的DNA，对Nekken、HZ及120个重组自交系进行测序并构建测序文库，比较了从HZ和Nekken获得的RILs之间的变异位点，并用隐马尔可夫模型方法[13]确定了它们的基因型．将相同基因型的连续SNP位点集中成区块，筛选出小于100 kb的单核苷酸多态性位点．并将结果进行分类整理统计，获得4 858个分子标记，这些分子标记均匀分布在水稻的12条染色体上，构建出覆盖范围广并且密度较高的遗传图谱．

2.4 QTL定位

在实验室前期已构建的高密度SNP分子标记连锁图谱基础上，采用区间作图法，用Mapmaker/QTL1.1B软件对糙米率进行QTL定位分析，将LOD设置为2作为阈值来判断QTL存在．

2.5 糙米率相关基因表达及分析

使用总RNA提取试剂盒(RNA simple total RNA kit)提取Nekken和HZ灌浆期叶片的RNA，按照反转录试剂盒使用说明将Nekken和HZ的总RNA反转成cDNA．根据QTL的定位结果，在水稻基因组注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查找相关区间内可能与糙米率有关的基因，利用实时荧光定量PCR对Nekken和HZ的候选基因进行表达差异分析，引物序列见表1．定量结果采用2-△△CT方法[14]进行分析．用Excel和SPSS 21.0等软件对数据进行显著性差异分析，实验数据间的显著性差异使用T检验进行比较．P<0.05代表具有显著性差异．根据候选基因Nekken和HZ表达量差异情况，选取表达量具有显著性差异的基因利用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Ve.2扩增并进行测序．

表1 实时荧光定量PCR的引物序列

3 结果分析

3.1 双亲和群体的表现

对双亲及重组自交系的糙米率进行检测，发现Nekken的糙米率为84%，而HZ的糙米率为76%，Nekken的糙米率相对于HZ的糙米率要高出约8%．RILs群体的糙米率数据呈现出连续的正态分布，范围较广泛，并且存在超亲个体(见图2)，符合QTL区间作图的需求．

图2 水稻重组自交系中糙米率的分布情况

3.2 QTL定位

利用该重组自交系事先构建的连锁遗传图谱进行QTL定位分析，该图谱包括4 858个标记的水稻分子标记，而且各标记均匀分布于全部水稻染色体上，完全适用于QTL区间作图的需求．本研究共检测到4个水稻糙米率相关QTL，分别位于第5，8，10，12染色体上(见表2和图3)．LOD值最大的QTL位于第8染色体上遗传距离为0.48～3.69 cM的区间内，LOD值为2.78．

表2 水稻糙米率的QTL分析

图3 水稻重组自交系糙米率的QTL定位

3.3 候选基因分析

通过对上述QTL所在区间进行候选基因分析，查阅水稻籽粒长宽比、厚度、品质相关文献，找出可能与糙米率相关的基因(见表3)，并对这些基因的功能和注释信息进行了初步总结与归纳.通过qRT-PCR分析发现，LOC_Os10g35440，LOC_Os08g01450，LOC_Os05g42210在HZ和Nekken当中均有显著性差异(见图4)．

表3 QTL定位区间候选基因及功能注释

图4 双亲中候选基因的表达情况

LOC_Os05g42210在Nekken当中表达量要显著高于HZ，而LOC_Os10g35440在Nekken当中表达量显著低于HZ，同时发现LOC_Os08g01450在双亲中表达量存在极显著的差异，而且该基因也位于效应最大的QTL位点内．因此，对HZ和Nekken当中LOC_Os08g01450进行测序，发现共有7处差异，且7处均为单碱基差异，分别位于第273位(HZ为G，Nekken为A)，第1 042处(HZ为G，Nekken为A)，第1 185处(HZ为G，Nekken为A)，第1 260处(HZ为A，Nekken为G)，第1 289处(HZ为T，Nekken为C)，第1 411处(HZ为G，Nekken为A)，第1 452位(HZ为T，Nekken为C)(见图5)，其中第1处、第2处和第7处的单碱基差异没有引起氨基酸的改变，第3处、第4处、第5处和第6处的单碱基差异引起氨基酸改变，分别位于第348位(HZ为缬氨酸，Nekken为异亮氨酸)，第420位(HZ为异亮氨酸，Nekken为甲硫氨酸)，第430位(HZ为缬氨酸，Nekken为丙氨酸)，第470位(HZ为天冬氨酸，Nekken为天冬酰胺)．由此推测，HZ与Nekken间的糙米率差异有可能是由于基因LOC_Os08g01450编码的氨基酸序列的差异而造成的.

a：LOC_Os08g42750位点分析；b：位点1；c：位点2；d：位点3；e：位点4；f：位点5；g：位点6；h：位点7

4 讨 论

目前有关于水稻糙米率的研究仍处在起步阶段，本研究利用HZ/Nekken构建的RILs群体定位到4个糙米率QTL，并通过对区间内基因的分析筛选出3个候选基因，分别编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体前体、细胞色素P450、含有五肽重复序列的蛋白质．

目前已有的研究表明，水稻糙米率受到不同基因的共同调控，LOC_Os05g42210编码1个表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体的前体，该前体通过调控细胞周期蛋白控制水稻籽粒大小和产量，其表达量的下降可能会引起籽粒变短[18]．LOC_Os08g01450编码1种酶，属于细胞色素P450家族[19]．LOC_Os08g01450基因的突变可能会引起种子中糖分的积累及籽粒产量的提高，对粒长粒宽也会有一定的影响．LOC_Os10g35440编码1个三角状五肽重复蛋白[20]，该蛋白在调控线粒体功能和水稻胚乳发育中发挥重要作用，其突变导致线粒体呼吸电子传递链中复合物I的组装减少，线粒体超微结构异常，同时ATP合成受阻，引起水稻营养期和生殖期生长明显减慢，成熟时米粒小且不透明，灌浆速率显著降低，千粒质量约降低36%，直链淀粉含量降低，胚乳中淀粉颗粒变小，且糊粉层细胞结构异常．

近几年，研究者通过构建不同的遗传群体对糙米率进行QTL定位并进行分析．梅德勇等[21]利用特青/IRBB的RILs群体在第6染色体短臂、第2染色体长臂、第7染色体长臂、第8染色体长臂和第10染色体长臂等共检测到8个糙米率的QTL位点，同时在第10染色体RM6100～RM3773检测到的QTL与本研究发现的qBR-3具有部分重合，而Ren等[22]利用TN1/CJ06的DH群体在第10染色体上RM258～RM1108区间内发现LOD值高达5.95的位点也与本位点非常接近，说明该位点很可能是一个稳定控制水稻糙米率的QTL位点．胡霞等[23]在第5染色体上RM161～RM3474区间发现的糙米率QTL也与本研究发现的qBR-1位点比较接近但并没有重叠，这可能是由于不同群体定位的糙米率QTL在遗传距离上存在一定的偏差，同时也说明在此附近可能存在与糙米率相关的QTL位点．除了这2个位点外，本次研究还发现了2个新的糙米率QTL位点，分别位于第8染色体RM22196～RM22277和第12染色体RM28127～RM28132的区间内．

水稻是世界重要的粮食产物之一，随着耕地面积的减少，培养出优质高产的水稻成为现在研究者的目标之一．加工品质是水稻的一个重要品质，改进水稻加工品质可以提高水稻产量，有效缓解粮食危机，保障我国的粮食安全．但是水稻加工品质的遗传是一个极其复杂的过程，不同研究方式得到的结果往往各不相同，甚至不同群体得到的结果也会有所不同．随着分子生物学的发展，分子标记育种已经逐渐应用到水稻育种的研究中，借助分子标记研究水稻加工品质将是未来研究方向之一．水稻糙米率是由多基因控制的数量性状，本研究利用HZ/Nekken构建的RILs群体得到的4个水稻糙米率QTL，为选育高糙米率的水稻品种提供一定的基础．但是QTL定位容易受到群体和材料的影响，因此，需要开展更多关于糙米率QTL的研究，进一步挖掘水稻糙米率QTL位点，寻找其中的主效基因，以加快高品质水稻的育种．