乌梅联合抗菌药物对猪大肠杆菌分离株的体外抑菌效果的研究

谢.江.吴健敏.陆有飞*.任春芝.梁珠民

（1.广西农业职业技术大学，广西 南宁 530007；2.广西兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001）

仔猪腹泻是养猪业中最常见病症，致病因素多种多样，包括营养性、病毒性和细菌性感染等。其中大肠杆菌感染是公认引起仔猪黄白痢的主要病因。大肠杆菌是一种条件致病菌，感染后主要引起严重的腹泻和发热，导致仔猪脱水休克死亡。不同饲养水平猪场仔猪黄白痢发病率、死亡率差异较大。有效控制大肠杆菌感染，可大幅减少仔猪黄白痢引起的死亡，减少经济损失。由于大肠杆菌血清型众多，变异大，抗原复杂，现有疫苗预防效果不佳，因此对大肠杆菌的控制目前仍然主要依靠抗菌药，但是抗菌药使用不当不仅会增加饲养成本，而且还可能因耐药造成治疗效果不佳。近年来，大量调查研究发现广西地区猪源大肠杆菌耐药性情况较为严重，因此开展有针对性药物筛选及抗菌素的联合用药以提高治疗效果，降低治疗费用具有十分重要的临床应用价值。

乌梅别名酸梅，为蔷薇科植物梅［（Sieb.）Sieb.et Zucc.］的干燥近成熟的果实，是我国传统中药材之一，为药食同源植物。中医将其用于治疗久痢，因为其多以果脯身份出现在市场，所以药用价值长期被人们忽略。近年来多数学者研究已证实其具有良好的抗菌作用，对大肠杆菌、葡萄球菌等多种致病菌有良好的抑制效果，但少有关于乌梅与抗菌药物联合用药的报道。加大对中药的研发力度，筛选出具有优良抗菌效果的中草药替抗产品，或中西药联合应用是动物疫病防治的一条新思路。本项目研究乌梅联合抗菌药物对广西某猪场多重耐药大肠杆菌分离株的体外抑菌试验，旨在研究中药乌梅的兽医临床用途，为仔猪黄白痢的治疗方案提供更多的参考依据。

1 试验材料

1.1 试验菌株

猪大肠杆菌分离株，血清型为O124，分离自广西某猪场发生腹泻病死哺乳仔猪，由广西农业职业技术大学分离鉴定并保存。此猪场连续发生仔猪腹泻，更换多种抗菌药物治疗，效果不佳。

1.2 试验药品

1.2.1 中药及炮制

乌梅购于老百姓大药房。干燥乌梅去核，果肉粉碎，称取乌梅肉粉75 g置于砂锅中，加入蒸馏水1000 mL，武火加热煮沸后，用文火煎煮30 min，随后趁热过滤，所得药液浓缩成500 mL，得到乌梅水提物，以生药计，浓度为150 mg/mL，置冰箱4℃保存。

鸡胆汁采自宰杀新鲜鸡胆，无菌采取胆汁液，置冰箱4℃保存。

1.2.2 试剂及抗菌药物

营养肉汤购于北京陆桥技术股份有限公司，药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司，痢菌净购于郑州德宝精细化工有限公司，硫酸小檗碱购于陕西夏州生物科技有限公司，TMP购于寿光富康制药有限公司，恩诺沙星购于浙江新昌制药厂，硫酸庆大霉素购于湖北康宝泰精细化工有限公司，均在有效期内。

1.3 试验仪器

酶标仪、超净工作台、蒸汽消毒锅、自动双重纯水蒸馏器、电热恒温干燥箱、恒温培养箱、无菌96孔板、微量移液器、电子分析天平。

1.4 培养基的制备

依据《兽医微生物学实验指导》，按常规方法制备营养肉汤、营养琼脂培养基、麦康凯培养基，经无菌检验合格，置4℃冰箱保存备用。

1.5 菌液的制备

将大肠杆菌分离株接种麦康凯培养基，37 ℃培养16 h后，挑取典型菌落接种营养肉汤，37 ℃增菌培养18 h，采用平板菌落计数法在营养琼脂培养基上测定菌液活菌数，再将菌液做10倍系列稀释为每毫升含1×10个活菌。

1.6 药液的制备

精确量取1.2.2项各抗菌药物，用灭菌双蒸水现配现用。痢菌净终浓度为0.4 mg/mL，硫酸小檗碱终浓度为40 mg/mL，TMP终浓度为4 mg/mL，恩诺沙星终浓度为25 mg/mL，硫酸庆大霉素终浓度为1.6 mg/mL。

1.7 乌梅药敏纸片的制备

乌梅药敏纸片的制备：在无菌条件下吸取1 mL乌梅水提物加入装有50片灭菌空白药敏纸片的青霉素瓶中，用牛皮纸密封瓶口，浸泡2 h，待药液被纸片充分吸净后烘干，-20℃保存备用。其它药敏纸片为商品化药敏纸片。

2 试验方法

2.1 纸片法抑菌试验

无菌取分离株菌液涂布至琼脂板，均匀的贴上药敏纸片，37 ℃培养24 h，参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的标准进行结果判断。

2.2 单药最低抑菌浓度（MIC）测定

1.6项中各种药物均采用微量肉汤二倍稀释法测定单药最低抑菌浓度。首先在无菌96孔板每一孔中均加入50 μL营养肉汤，再在每一行的第1孔中加入50 μL配制好的药物原液进行倍比稀释，稀释至第11孔弃去50 μL，第12孔为无药对照孔，最后各孔均加入50 μL 稀释好的1.5项菌液。振荡混匀，加盖置37 ℃孵育10~14 h后观察结果。单药最低抑菌浓度判定方法：无细菌生长的稀释孔所含药物浓度即为该药大肠杆菌分离株的MIC。

乌梅水提物（150 mg/mL）和鸡胆汁也按上述方法测定其对大肠杆菌分离株的MIC。

2.3 棋盘法联合抑菌试验

根据MIC测定结果，用营养肉汤将1.6项各药液及乌梅水提物分别配成MIC的2倍、1倍、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32工作液各5 mL；将鸡胆汁原液 配 制 成 1倍、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64工作液各5 mL。将乌梅分别与痢菌净、硫酸小檗碱、TMP、恩诺沙星、硫酸庆大霉素、鸡胆汁进行联合抑菌试验，每个无菌96孔板做一个组合，两种药物的稀释分别在无菌96孔板上按横列和纵列进行联合。操作方法如下：取50 μL乌梅水提物MIC的2倍、1倍、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32工作液，依次加入无菌96孔板的第2、3、4、5、6、7、8列；取50 μL各试药不同稀释度工作液，浓度由高到低依次加入无菌96孔板的第B~H行的第1~8孔，第12孔为无药对照孔，除无药对照孔外，各孔均加入50 μL稀释好的1.5项菌液；另设只加菌液和营养肉汤为阳性对照孔，只加营养肉汤为阴性对照孔。同样方法进行乌梅与鸡胆汁的棋盘试验。

振荡无菌96孔板使之混合均匀，加盖置37 ℃孵育10~14 h后观察结果。联合抑菌试验的判定方法：以部分抑菌浓度（FIC）指数作为依据，FIC指数＞2为两药拮抗，1＜FIC指数≤2为两药无关，0.5＜FIC指数≤1为两药相加，FIC指数≤0.5为两药协同。

FIC指数=（A药联合时的MIC/A药单独时的MIC）+（B药联合时的MIC/B药单独时的MIC）

3 结果与分析

3.1 纸片法抑菌试验结果

纸片法抑菌试验结果见表1。由表1可见该菌株对150 mg/mL乌梅和75 mg/mL乌梅中度敏感，18.75 mg/mL乌梅低度敏感，表明乌梅对本临床分离株大肠杆菌有较好的抑菌作用。从抗菌素检测结果看，该菌株对哌拉西林、头孢拉定、头孢曲松、多西环素、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素等中度敏感，对氧氟沙星低度敏感，对青霉素、羧苄西林、头孢氨苄、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、克林霉素、新霉素等药物耐药，说明该临床分离株为多重耐药菌株，与猪场临床使用多种抗菌药物进行治疗效果不佳表述相符。

表1 纸片法抑菌试验结果

续表

3.2 单药最低抑菌浓度（MIC）测定结果

单药最低抑菌浓度（MIC）测定结果见表2。从单独使用各种药物的抑菌结果看，痢菌净、恩诺沙星、硫酸庆大霉素的MIC较低，本菌株对这些药物敏感，可作为该场治疗的首选药物。TMP和硫酸小檗碱对大肠杆菌分离株的MIC较高，抑菌作用不如上述3种药物。乌梅对大肠杆菌分离株的MIC为9375 μg/mL，表明对该菌株具有一定的抑制作用。鸡胆汁无抑制作用。

表2 单药最低抑菌浓度（MIC）测定结果

3.3 棋盘法联合抑菌试验结果

棋盘法联合抑菌试验结果见表3，在棋盘法体外大肠杆菌抑制实验中，乌梅与TMP、痢菌净联合用药呈现相加作用，TMP、痢菌净对大肠杆菌分离株的MIC分别降至1/2、1/4，乌梅对本分离株的MIC也降至1/2，表明乌梅与TMP、痢菌净联合用药能起到增效作用；但乌梅与硫酸庆大霉素、硫酸小檗碱、恩诺沙星联合用药呈拮抗作用。

表3 棋盘法联合抑菌试验结果

4 小结与讨论

抗菌药物过度使用、滥用，导致耐药菌株不断出现已成为养殖业的一大危害。本试验分离的大肠杆菌，对兽医临床上常用的抗菌药物如青霉素、羧苄西林、头孢氨苄、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、克林霉素、新霉素等均耐药，是一株多重耐药菌株，导致临床用药效果不佳。因此，在兽医临床上用药敏试验筛选敏感药物进行治疗是很有必要的。

试验结果显示，乌梅水提液对本试验分离的多重耐药菌株的MIC为9375 μg/mL，说明乌梅对大肠杆菌具有一定的抑制作用，这与同类研究报道相符，可能与乌梅中酚类化合物、有机酸等有效成分对肠道细菌的抑制作用有关。从已有的报道看，黄柏（0.5 g/mL）、穿心莲（1 g/mL）、淫羊藿（62.5 g/mL）、含珠草（0.5 g/mL）、透骨草（0.125 g/mL）、蒲公英（0.25 g/mL）等水提物对大肠杆菌的MIC均高于乌梅水提物，说明乌梅对大肠杆菌的抑制作用更强。

痢菌净、硫酸小檗碱、恩诺沙星、硫酸庆大霉素都是肠道细菌感染常用药物，TMP为肠道不易吸收的抗菌药物，通常作为磺胺类药物和其他药物的抗菌增效剂，也有对中药抗菌增效作用的报道，因此本试验选择上述药物进行联合抑菌试验。棋盘法联合抑菌试验结果表明，乌梅水提物与抗菌药物联用有选择性的增强作用。与硫酸庆大霉素、硫酸小檗碱、恩诺沙星联合应用时呈拮抗作用，与痢菌净、TMP联合应用时呈现相加作用，与TMP对中药有抗菌增效作用的报道相符。因此在临床治疗上可推荐为首选用药。

本试验尝试用乌梅水提物与鸡胆汁联合对大肠杆菌进行抑菌试验，结果显示也呈相加作用。

在细菌对常用药物耐药性普遍提升的环境下，联合用药是解决仔猪腹泻临床用药效果不佳的常见途径。因此寻找对多重耐药大肠杆菌有抑制作用且对药物抗菌效果有协同或相加作用的中药，制备出廉价高效的中西复方制剂，或为临床联合用药提供有效治疗方案也是今后的研究趋势。乌梅除具备来源广泛、药食同源、绿色无残等优势外，在大肠杆菌性腹泻治疗中，将会有非常好的临床应用和进一步的研究价值。