宠物猫源病原菌分离鉴定及药物敏感性分析

耿娟， 韩荣嘉， 刘建华， 陈上将， 翟亚军， 范钟锈， 苑丽， 吴华

(河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450046)

猫作为伴侣动物可以满足人类的情感需要，具有非常重要的情感价值。根据中国《2021年宠物行业白皮书》报告数据显示，猫在宠物中所占比例达到59.5%，已经超过了犬成为人类饲养最多的宠物[1]。但是，猫也是常见的细菌携带者和传染源，能携带多种与人类相关的病原菌，加之在中国城镇家庭中宠物猫经常与人类共同居住，接触频繁，导致由猫传播的细菌性传染病呈高发趋势，且存在细菌感染和耐药性菌株横向传播的风险[2-3]。相关研究表明，猫和人类在临床治疗细菌感染性疾病时所使用的部分抗菌药物一致或多数一致，这意味着相同耐药背景的耐药菌会产生人兽互相传递的风险[4]。患病宠物体内会携带大量与人类健康密切相关的耐药菌群，无论患病及康复后的宠物都被认为是潜在的抗性细菌库，猫也不例外[5]。此外，猫还会通过排泄、呼吸和添食等途径导致耐药菌群的二次传播[6]。同时，猫自身携带的多重耐药菌群会和人源多重耐药菌群发生交叉传播，在公共卫生层面上对抗生素及抗菌药的使用产生较大影响[7-9]。

关注宠物猫源病原菌的耐药表型及多重耐药情况，将有助于了解宠物猫临床抗生素及抗菌药的使用情况，对制定合理的临床抗菌治疗方案以及减缓人医和兽医临床多重耐药菌株的增加与横向传播而言意义重大。中国国内部分地区已经有针对当地宠物病原菌的耐药性检测及其多重耐药分析的研究[10-13]，但郑州地区有关此类研究报道相对较少。同时，已有研究多集中于宠物犬源病原菌耐药性的探讨，而对宠物猫携带的病原菌的药物敏性研究和多重耐药分析较为匮乏。本研究针对郑州市宠物猫源病原菌进行分离鉴定、药物敏感性分析及多重耐药表型探究，旨在了解和掌握郑州市宠物源主要病原菌的多重耐药情况，为宠物猫临床合理使用抗生素或抗菌药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 于2021年7—9月在郑州市多家宠物医院无菌采集宠物猫(15只美短、8只英短、21只布偶、11只狸花和8只折耳)咽拭子、鼻拭子和肛拭子共计63份样品。其中，健康宠物猫49份，患病宠物猫14份。

1.1.2 培养基及标准菌株 麦康凯(MacConkey，MacC)琼脂培养基(大肠杆菌选择培养基)、沙门志贺菌属(salmonella-shigella，SS)琼脂培养基(沙门氏菌选择培养基)、肠球菌琼脂培养基、BP(Baird-Parker)琼脂培养基(加入质量分数5%亚碲酸盐卵黄增菌液)和LB(lysogeny broth)肉汤培养基均购自河南天驰生物公司。质控菌株为河南农业大学动物医学院药理学实验室保存菌株，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)标准质控菌株ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)标准质控菌株ATCC 29213、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)标准质控菌株ATCC 29212。

1.1.3 药品 本研究中药物分为7类14种(6类12种抗生素，以及氟喹诺酮类2种抗菌药物)。β-内酰胺类抗生素包括头孢喹肟(cefquinome, CFQ)、头孢噻呋(ceftiofur, CEF)和阿莫西林(amoxicillin, AMX)；四环素类抗生素包括多西环素(doxycycline, DOX)和替加环素(tigecycline, TGC)；酰胺醇类抗生素包括氟苯尼考(florfenicol, FFC)；氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素(gentamicin, GEN)和阿米卡星(amikacin, AMK)；大环内酯类抗生素包括泰乐菌素(tylosim, TYL)、阿奇霉素(azitromycin, AZM)和替米考星(tilmicosin, TIL)；氟喹诺酮类抗菌药包括恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)和氧氟沙星(ofloxacin, OFX)；多肽类抗生素包括黏菌素(colistin, COL)。上述药品均购自河南天驰生物科技有限公司，分析纯。药液初始质量浓度统一配制为5 120 μg·mL-1。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离与纯化 将无菌采集的宠物猫鼻拭子、咽拭子和肛拭子加入至 5 mL LB肉汤培养基中，37 °C振摇培养12 h，肉汤浑浊后用接种环挑菌接种于血平板上，37 ℃培养 18～24 h可见不同形态的细小菌落。挑取不同形态的菌落分别划线接种于MacC、SS、BP及肠球菌琼脂培养基培养18～24 h，挑取生长良好的单个菌落再次分别接种上述琼脂固体培养基中，分离纯化至3代以上，至呈现单一明确菌落。

1.2.2 染色镜检 对选择培养后疑似大肠杆菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)及沙门氏菌(Salmonella)等进行革兰氏染色、镜检观察。挑取纯化单菌落加生理盐水后涂匀至载玻片中心，按照初染、媒染、脱色和复染4个步骤进行染色，最后通过奥林巴斯光学显微镜(CX23，日本)进行镜检观察(×1 000)。

1.2.3 16S rRNA鉴定 将镜检疑似菌株进行16S rRNA通用引物扩增和特异性引物扩增，扩增产物送北京擎科生物科技有限公司测序。引物设计由河南农业大学动物医学院兽医药理学实验室完成，并由北京擎科生物科技有限公司合成。通用引物16S rRNA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S rRNA-R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT；扩增目的片段长度为1 600 bp。沙门氏菌特异性引物(invasionproteinA,invA)invA-F：AAAAGAAGGGTCGTCGTTAG；invA-R：TACCACTCGCATCAAATCAA；预期扩增片段长度为280 bp。PCR扩增体系为20 μL，2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL，模板2 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃(退火温度由上下游引物决定)退火30 s，72 ℃延伸2 min(延伸时间由片段长度决定);30个循环后72 ℃延伸10 min，同时设阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统观察结果后，送北京擎科生物科技有限公司测序，并进行Blast比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.4 药物敏感性试验 依据美国临床实验室标准委员会(Clinical and laboratory Standards Institute, CLSI)(2020)[14]推荐的微量肉汤稀释法测定各种抗生素及抗菌药对宠物猫源病原菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。以ATCC 25922作为大肠杆菌和沙门氏菌的标准质控，以ATCC 29213作为葡萄球菌的标准质控，以ATCC 29212作为肠球菌的标准质控。如上述标准质控菌对被检抗菌药物MIC在质控范围内，且阳性对照有细菌生长，阴性对照无细菌生长，测得MIC结果有效。CFQ的MIC耐药折点依据参考文献[15]，其他药物MIC依据CLSI(2020)[14]和欧洲抗菌药物敏感试验委员会(The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST)(2019，2020)标准进行结果判定[16-17]。

1.2.5 药物多种及多重耐药试验 多种耐药统计方法是把对被检抗菌药物中的1种药物耐药统计为1耐(1R)，对被检抗菌药物中的2种药物耐药统计为2耐(2R)，以此类推；多重耐药的表型确定标准是同时对3类抗生素(抗菌药)耐药[18]。

2 结果与分析

2.1 宠物猫源病原菌分离与鉴定

2.1.1 宠物猫源病原菌16S rRNA与invA基因鉴定 宠物猫源病原菌经选择培养和分离纯化后进行革兰氏染色镜检，选择疑似大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌和葡萄球菌通过16S rRNA通用引物进行PCR扩增鉴定，并对疑似沙门氏菌进行特异基因invAPCR扩增鉴定，结果见图1。通过Blast比对，各种菌株分别与对应标准菌株的16S rRNA序列以及沙门氏菌invA基因序列同源性都大于99%。

M, DL2000; 1～17，试验菌株；其中15、17是沙门氏菌invA基因PCR扩增结果。

2.1.2 宠物猫源病原菌分离鉴定结果 本试验从63份样品中总计分离获得42株细菌，结果见表1。其中，大肠杆菌和肠球菌的分离率最高，分别是16株(16/42，38.1%)和14株(14/42，33.3%)，属于宠物猫病原菌优势菌群[5]；获得葡萄球菌8株，分离率为19.1%(8/42)；沙门氏菌株4株，分离率最低为9.5%(4/42)

表1 宠物猫源病原菌菌株分离数量与分离率Table 1 Number of strain isolates and the isolation rate of pathogens isolated from companion felines

2.2 宠物猫源病原菌药物敏感性试验

2.2.1 大肠杆菌和肠球菌药物敏感性试验 如表2所示，宠物猫源大肠杆菌对β-内酰胺类的3种抗生素CFQ、CEF和AMX的耐药率比较高，分别是56.3%、68.8%和100.0%；对四环素类药物DOX的耐药率为37.5%，而对TGC的敏感率为100.0%；对酰胺醇类兽医专用抗生素FFC的耐药率为31.3%；对氨基糖苷类药物AMK和GEN的敏感率分别为75.0%和43.8%，耐药率均为25.0%；对大环内酯类抗生素AZM的敏感率相对较高，为87.5%；而对氟喹诺酮类药物ENR和OFX的敏感率均为68.8%；多肽类抗生素COL因其独特的作用机制，对宠物猫源大肠杆菌的敏感率为100.0%。因此，对宠物猫源大肠杆菌敏感性最强的抗菌药物依次是COL(100.0%)、TGC(100.0%)、AZM(87.5%)、AMK(75.0%)、ENR(68.8%)和OFX(68.8%)；而耐药性较为严重的则是AMX(100.0%)、CFQ(68.8%)和CEF(56.3%)。

表2 宠物猫源大肠杆菌和肠球菌药物敏感性试验结果

宠物猫源肠球菌除对CEF和AZM的耐药性较高以外，对其他类抗生素的敏感性均较强，14株肠球菌全部对CEF耐药(100.0%)，对AZM的耐药率达到50.0%；而对肠球菌比较敏感的药物依次是TGC、OFX、FFC、DOX、AMX、TYL和ENR，敏感率依次是100.0%、92.9%、85.7%、78.6%、78.6%、71.4%和71.4%。这表明猫源大肠杆菌的总体耐药情况较肠球菌严重。

2.2.2 葡萄球菌和沙门氏菌药物敏感性试验 14种药物对猫源葡萄球菌和沙门氏菌株的MIC与耐药判断结果如表3所示。葡萄球菌耐药率较高的药物依次是DOX(100.0%)、CEQ(87.5%)、CEF(75.0%)和TYL(62.5%)，而8株葡萄菌对AMX、FFC、OFX这3种药物全部敏感。此外，葡萄球菌对TGC、ENR、AZM和TIL的耐药率较低，敏感率依次为87.5%、87.5%、62.5%和62.5%。4株沙门氏菌的耐药现象也较为普遍，对AMX、DOX和GEN这3种药物全部耐药(4/4)，对FFC的耐药率也较高(3/4)；4株菌中有2株对CEQ、TGC、AZM和ENR耐药；4株沙门氏菌对OFX和COL全部敏感。而对于宠物猫源沙门氏菌而言，GEN主要用于检测高水平耐药，不用于临床抗菌活性评价[14]，4株猫源沙门氏菌中有3株GEN的MIC≥64，1株GEN的MIC≥32，4株均表现出对氨基糖苷类抗生素的高水平耐药(MIC>32)。

表3 宠物猫源葡萄球菌和沙门氏菌MIC及药物敏感性结果

2.3 宠物猫源病原菌多种及多重耐药结果分析

本研究中药物分为7类14种，包括6类12种抗生素及氟喹诺酮类2种抗菌药物。宠物猫源病原菌的多种耐药分布情况见图2。42株宠物猫源病原菌株中，100%(42/42)的菌株出现对抗菌药物的耐药性，最少是1耐，最多是11耐。33株耐4种及以上药物，占宠物猫源病原菌株总数的78.6%(33/42)，其余9株分别耐1类或2类抗菌药中的1～3种药物。92.9%的病原菌株出现耐2种及其以上药物种类，其中6耐的菌株数最多(9株)，占多重耐药菌株总数的47.4%(9/19)；5耐的菌株数仅次之(8株)，占多重耐药菌株总数的42.1%(8/19);7耐、8耐的菌株数分别有3株、4株，占多重耐药菌株总数的15.8%(3/19)和21.1%(4/19);4耐的菌株数为7株，占多重耐药菌株总数的36.8%(7/19)；9耐和11耐的菌株数分别为1株，合计占多重耐药菌株总数的10.5%(2/19)。这种耐药情况比较严重，较为少见。

图2 宠物猫源病原菌对14种抗菌药物的多种耐药分布

宠物猫源病原菌的多重耐药分布情况见图3。针对7类抗菌药物，多重耐药菌株(耐3类及以上药物)共19株，占宠物猫源病原菌株总数的45.2%(19/42)；耐3类有6株，耐4类有9株，耐5类有3株，耐6类有1株，没有检测到对7类药物全部耐药的菌株。在多重耐药菌株中比例最高的是4重耐药(47.4%，9/19)，同时有1株沙门氏菌表现出6重耐药，即对β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、酰胺醇类、大环内酯类抗生素及氟喹诺酮类药物同时出现耐药，仅对黏菌素敏感，值得重点关注和深入研究。

图3 宠物猫源病原菌对7类抗菌药物的多重耐药分布

3 结论和讨论

本研究结果表明，郑州市宠物猫源大肠杆菌和沙门氏菌的多重耐药情况较为普遍。其中，郑州市宠物猫源大肠杆菌对β-内酰胺类3种抗生素耐药较为严重，这与吴立婷[3]和赵雪洋等[19]研究相近，推测是Ⅲ代头孢菌素在宠物临床治疗时应用较为广泛所致。此外，郑州市宠物猫源大肠杆菌对头孢菌素CEF和CFQ的耐药率明显高于赵雪洋等[19]和佟盼盼等[20]的报道，这与不同地区宠物临床用药习惯不一致有关。郑州市宠物猫源大肠杆菌对动物专用抗生素第四代头孢菌素CFQ产生严重的耐药性现象，这值得引起警示，其耐药机制需要进一步深入研究。大肠杆菌对四环素类抗生素DOX、氟喹诺酮类药物ENR和OFX的耐药率明显低于中国其他地区[21-22]，结合郑州市宠物医院用药情况，推测是这2类药物适用于宠物临床的药物制剂较少，限制了其在宠物临床的应用。新型四环素类抗生素TGC的敏感性最高，属于郑州市宠物猫源病原菌首次报告。抗生素COL因其较强的肾毒性未被批准在宠物临床体内应用，故本研究结果显示其对宠物猫源大肠杆菌敏感性亦较高，符合宠物临床抗感染用药实际情况。兽医专用抗生素FFC在宠物临床批准使用时间较短，也出现耐药性，推测可能由人源和食源多重耐药菌株的水平传播所致。这与轩慧勇等[23]研究结果一致，但与MAALAND等[24]和GMEZ-BELTRN等[25]研究结果不一致，推测该现象与地域环境以及FFC用药习惯有关。宠物猫源沙门氏菌的耐药现象也较为突出，其多重耐药谱型普遍较宽，仅有的1株7重耐药菌株是沙门氏菌，主要针对β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类和酰胺醇类等抗生素产生耐药，且以5耐为主，这与轩慧勇等[23]、黄凯等[26]对动物源沙门氏菌、犬源沙门氏菌的多重耐药报道一致。但由于本研究中宠物猫源沙门氏菌的分离率较低，样本数较少，导致其耐药谱型较为单一和集中。

与革兰氏阴性菌大肠杆菌和沙门氏菌相比，郑州市宠物猫源肠球菌多重耐药情况较轻，除对抗生素CEF和AZM耐药率较高外，对其他类抗生素的敏感性均较强，这与潘嘉臻[5]和宋超慧等[8]报道一致。目前，肠球菌已是人医和兽医临床感染率较高的细菌且临床治疗较为困难，故加强对其耐药性监控及多重耐药表型分析，对有效预防与控制肠球菌耐药机制的水平或垂直传播具有重要参考价值。本研究中仅有1株葡萄球菌对抗生素AMX、FFC和OFX敏感，对其他抗生素均呈现耐药，对新型抗生素TGC也表现为耐药，而宿主宠物猫并未进行过此类抗生素的治疗，其耐药机制值得深入研究和重点关注。葡萄球菌对β-内酰胺类兽医专用抗生素CEF和CFQ具有较高耐药性，对氨基糖苷类、酰胺醇类和氟喹诺酮类等抗生素亦有不同程度的耐药水平，这与国内外宠物源葡萄球菌多重耐药性报道一致[25, 27]，也符合兽医临床实际用药情况。葡萄球菌作为宠物猫临床常见的优势致病菌株，其多重耐药性需引起兽医临床的高度重视和关注。

本研究表明，郑州市宠物猫源病原菌的多重耐药现象非常普遍，且存在高水平耐药情况，推测其与宠物临床抗生素或抗菌药的不规范和超剂量使用有关，同时也可能由人与食品、环境等公共卫生链的耐药机制横向传播所致，故多重耐药机制及耐药基因种类值得进一步深入研究。