小鼠Skint6基因突变对脾脏淋巴细胞亚群的影响①

王 惠 战 倩 穆高航 李秀峰 王艺璇 徐志伟 鞠吉雨

（潍坊医学院免疫学教研室，潍坊 261053）

遗传因素在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）发病中发挥重要作用［1］。目前人类全基因组关联研究（GWAS）已发现100 多种狼疮易感基因，但由于临床研究的局限性，其致病机制极少在人体中得到确证。因此，研究自发性SLE模型小鼠发病机制对揭示人类SLE发病机制具有重要意义［2］。自发性SLE模型小鼠NZM2410品系中已发现3 个狼疮易感基因座，分别为 Sle1、Sle2、Sle3。前期研究发现，Sle2 基因座内上皮内T 细胞的选择和维持分子6（selection and upkeep of intraepithelial T cells 6，Skint6）基因发生点突变，提前形成终止密码，导致蛋白翻译中断，因此推测这种突变可能与Sle2 基因座致病特性有关［3-4］。本研究通过CRISPR/Cas9 技术制备Skint6 基因突变小鼠模型，并对该模型小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例变化进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 野生型B6-WT（B6 wild type）小鼠购自南京大学模式动物中心；基因突变B6-Skint6M（B6 Skint6 mutant）小鼠委托赛业生物科技有限公司（广州）制备，均为6 月龄，每组12 只，雌雄各半，饲养于SPF环境。所有实验操作均经潍坊医学院实验动物伦理学委员会批准。

1.1.2 试剂 考马斯亮蓝5×G-250、红细胞裂解液购 自 Solarbio 公 司 ；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂购 自 TaKaRa 公司；HRM 扩增试剂购自Roche 公司；转录因子测定试剂盒购自eBioscience 公司；FACS 检测所用抗体：大鼠抗小鼠CD16/CD32 抗体、PE 标记的CD3、CD1d、PD-1、Foxp3 抗体、V450 标记的 CD19、CD69、CD25 抗体、APC 标记的 NK1.1、CD19、CXCR5 抗体、PE-Cy5 标记的 CD4 抗体、FITC 标记的 CD4、CD44、CD5、B220抗体均购自BD Pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 B6-Skint6M小鼠制备及鉴定 将小鼠Skint6基因的 gRNA（guide RNA）和 含 W168*（TGG 至TGA）突变的供体寡核苷酸及Cas9 共同注射到小鼠受精卵中，产生靶向的敲入后代，gRNA 靶序列为：5'-ATGCATCCCCCCCAAACAGCACAGG-3'。SDS 法提取鼠尾DNA，根据小鼠基因组序列设计一对引物，其中正向引物：5'-CTCCATTCCATGTGAGGCT‑GT-3'（113236415~113236435），反向引物：5'-CT‑GTTTTGTTTTCAACCAGCTACA-3（'113236539~113-236516），扩增片段长度 125 bp。HRM-PCR 筛选B6-Skint6M突变小鼠，反应条件：先加入 2×Master Mix 10 µl，正反向引物各0.5 µl，MgCl23 µl，DNA 模板1µl，ddH2O补足体积至20µl。扩增条件：预变性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45 个循环；HRM 程序 95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s；冷却40 ℃10 s。PCR产物进行20 g/L琼脂糖电泳和测序。测序引物为：5'-CACATTATACCTGGTAGGA‑CAAAG-3'。

1.2.2 小鼠体质量及脾脏指数的测定 CO2处死小鼠，称取小鼠体质量及脾脏质量，计算脾脏指数=脾脏湿重（mg）/小鼠体质量（g），并进行比较。

1.2.3 小鼠尿蛋白测定 考马斯亮蓝G-250 法测定两组小鼠尿蛋白，将标准品按0、2、4、6、8、12、16、20 µl分别加至96孔板，加1×PBS补足体积至20 µl。将收集的小鼠尿液进行适当稀释，取20 µl 加入96 孔板，各孔加入200 µl 稀释后的染色液，室温放置3~5 min，酶标仪测定各样本595 nm 处对应的吸光度值（A595），绘制标准曲线并计算两组小鼠尿蛋白含量，连续测定3 d。

1.2.4 qRT-PCR 检 测 小 鼠 皮 肤 Skint6 mRNA 表达 CO2处死小鼠，取每只小鼠取皮肤约50 mg置于研磨器中，立即加入2 ml RNAiso Plus 提取皮肤总RNA 并进行逆转录为cDNA。Skint6 基因扩增正向引物：5'-GCACATGGAAATTCGCTGGTT-3'，反向引物：5'-AAGAAGCAGTGGTAGGACCC-3'，扩增片段为201 bp。以β-actin 为内参，扩增片段为200 bp。PCR 反应条件：94 ℃预变性 2 min，94 ℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃ 30 s，扩增 40 个循环。扩增产物行 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物条带位置。根据ΔCt=CtGene−Ctβ-actin，2−ΔΔCt计算 mRNA 相对表达，各样品重复3次。

1.2.5 FACS 测定小鼠脾脏淋巴细胞亚群 取小鼠脾脏中段约50 mg 置于研磨器中，加入3 ml PBS冰上充分研磨，转至15 ml离心管，350 g 离心5 min，弃上清，加入7 ml 红细胞裂解液重悬，冰上裂解5 min，混匀 2~3 次，加入 PBS 终止裂解，350 g 离心5 min，弃上清，PBS 洗涤细胞后计算脾细胞总数。流式染色缓冲液调整细胞浓度至1×107个/ml并进行免疫细胞染色，其中PE-CD3 标记T 细胞、V450-CD19 标记 B 细胞、PE-CD3、FITC-CD4 标记辅助/诱导 T 淋巴细胞、PE-CD3、Pacific blue-CD8 标记细胞毒性 T 细胞、PE-CD3、FITC-CD4、Pacific blue-CD8 标记 DNeg 细胞、APC-NK1.1 标记 NK 细胞、PE-Cy5-CD4、V450-CD69、FITC-CD44 标记活化的 CD4+T 细胞、FITC-CD4、CD25-V450、PE-Foxp3 标记调节性 T细胞（Treg）、FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-CD1d 标记滤泡辅助性T（Tfh）细胞、APC-CD19、FITC-CD5、PECD1d标记调节性B细胞（Breg）、PE-CD3、B220-FITC标记非典型CD3+B220+细胞，每管加入100 µl 细胞悬液并加入1µl 封闭抗体（大鼠抗小鼠CD16/CD32抗体），4 ℃避光孵育10 min，分别加入相应亚群标记抗体进行细胞表面分子染色，4 ℃避光孵育40 min，染色缓冲液洗涤2 次，400µl 染色缓冲液重悬细胞，300 目滤网过滤后上机检测。Treg 亚群测定：根据上述步骤进行CD4-FTIC、CD25-V450 抗体染色，染色结束后每管加入500 µl 破膜固定液，4 ℃避光孵育 40 min，加入 1 ml 破膜洗液 4 ℃ 、1 400 g 离心5 min，洗涤2次，加入Foxp3-PE抗体染色4 ℃避光孵育40 min，1 ml破膜洗液洗涤2次，过滤上机检测。

1.3 统计学分析 FACS 检测结果采用Flow10.0软件进行分析，统计学分析采用GraphPad Prism 8.0软件，计量资料采用表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 B6-Skint6M小鼠鉴定 HRM-PCR 小鼠基因分型鉴定结果显示：B6-WT 小鼠DNA 扩增片段的TM值为 83.52 ℃；B6-Skint6+/−杂合子小鼠 DNA 扩增片段TM 值为 82.30 ℃；B6-Skint6M小鼠 DNA 扩增片段TM 值为 83.08 ℃，即小鼠 DNA 扩增片段 TM 值B6-WT>B6-Skint6M>B6-Skint6+/−，可有效区分 3 种小鼠。琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增片段长度为125 bp，符合预期。DNA 序列测定结果表明，B6-Skint6M在504位核苷酸发生G 到A 的改变，Skint6基因突变小鼠构建成功（图1）。

图1 Skint6基因突变小鼠鉴定Fig.1 Identification of Skint6 gene mutant mice

2.2 qRT-PCR 检 测 小 鼠 Skint6 mRNA 表 达qRT-PCR 结果表明，两组小鼠皮肤均可检测到Skint6 mRNA 表达，与对照组 B6-WT 小鼠相比，实验组B6-Skint6M小鼠mRNA 水平差异无统计学意义（P>0.05，图2）。

图2 小鼠皮肤中Skint6 mRNA水平Fig.2 Skint6 mRNA level in mouse skin

2.3 Skint6 基因突变对小鼠体质量、脾脏指数的影响 两组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）。B6-Skint6M雄性小鼠和雌性小鼠与相应性别的B6-WT 小鼠组相比，脾脏指数差异无统计学意义（P>0.05，表1）。

表1 Skint6 基因突变对B6-WT 小鼠体质量、脾脏指数的影响（，n=6）Tab.1 Effects of Skint6 gene mutation on body mass and spleen index of B6-WT mice（，n=6）

表1 Skint6 基因突变对B6-WT 小鼠体质量、脾脏指数的影响（，n=6）Tab.1 Effects of Skint6 gene mutation on body mass and spleen index of B6-WT mice（，n=6）

Groups B6-WT ♂B6-Skint6M ♂B6-WT ♀B6-Skint6M ♀Weight/g 32.51±1.70 31.26±0.79 23.15±2.10 21.73±0.79 Spleen index/（mg·g−1）3.10±0.53 3.40±0.59 3.70±0.33 4.10±0.45

2.4 小鼠尿蛋白测定 两组小鼠尿蛋白定量测定结果表明，与B6-WT组雄性小鼠尿蛋白相比，B6-Skint6M雄性小鼠尿蛋白含量明显增高（P<0.001，图3A）；同样，与B6-WT 组雌性小鼠的尿蛋白相比，B6-Skint6M雌性小鼠尿蛋白含量也明显增高（P<0.05，图3B）。

图3 Skint6基因突变对B6-WT小鼠尿蛋白影响Fig.3 Effects of Skint6 gene mutation on urine protein of B6-WT mice

2.5 Skint6 基因突变导致小鼠脾脏淋巴细胞亚群比例失调 FACS 及细胞计数结果表明，与B6-WT小鼠相比，B6-Skint6M模型小鼠脾脏细胞总数及淋巴细胞总数明显增多（P<0.01），其脾脏淋巴细胞亚群中CD3+T 细胞比例及细胞绝对数均明显增高（P<0.01，图4A；P<0.05，表2），CD19+B淋巴细胞比例明显降低（P<0.05，图4B，表2），但其细胞绝对数差异无统计学意义（P>0.05，表2），NK1.1 细胞亚群比例及细胞绝对数差异均无统计学意义（P>0.05，表2）。进一步分析两组小鼠脾脏CD3+T 淋巴细胞亚群中CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞亚群比例及细胞计数，发现与B6-WT 小鼠相比，B6-Skint6M小鼠脾脏CD3+T淋巴细胞亚群中CD4+T细胞亚群比例差异无统计学意义（P>0.05，表2），但其细胞绝对数明显增多（P<0.05，表 2），CD8+T 细胞比例明显降低（P<0.01，图4C，表2），其细胞绝对数差异无统计学意义（P>0.05，表2），CD4/CD8增高（P<0.01，表2）且DNeg细胞比例及细胞绝对数均明显增高（P<0.01，图4D；P<0.05，表2）；进一步分析T 细胞膜分子表达发现，CD4+CD69+活化T 细胞比例及细胞绝对数均明显增高（P<0.05，图4F；P<0.01，表2），CD4+CD44hiT 细胞比例及其细胞绝对数均明显增高（P<0.01，图4E；表 2），Treg 比例及绝对数明显降低（P<0.001，图4H、表2），Tfh 细胞比例及绝对数明显增高（P<0.05，图4G、表2）。此外，B6-Skint6M小鼠脾脏Breg比例及细胞绝对数明显增高（P<0.05，图4I、表2）；CD3+T 淋巴细胞亚群中非典型CD3+B220+T 细胞亚群比例及细胞绝对数明显增高（P<0.001，图4J、表2）。

图4 Skint6基因突变对小鼠脾脏淋巴细胞亚群的影响Fig.4 Effect of Skint6 gene mutation on mice spleen lymphocyte subsets

表2 两组小鼠脾脏淋巴细胞亚群比较（，n=6，%）Tab.2 Comparison of splenic lymphocyte subsets of two groups of mice（，n=6，%）

表2 两组小鼠脾脏淋巴细胞亚群比较（，n=6，%）Tab.2 Comparison of splenic lymphocyte subsets of two groups of mice（，n=6，%）

Note：Compared with control group，1）P<0.05，2）P<0.01，3）P<0.001.

Items Control（%）B6-Skint6M（%）1.39±0.041）2.87±0.15 1.19±0.102）3.48±0.192）0.02±0.003）0.53±0.091）0.51±0.061）0.74±0.083）Total WBC Total lymphocytes CD3+CD19+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD4–CD8–CD4/CD8 NK1.1 CD4+CD69+CD4+CD44hi Treg Tfh Breg CD3+B220+−Cell counts（×106）72.18±4.84−Cell counts（×106）93.58±4.972）72.54±0.3552.19±2.0565.40±0.533）60.46±1.792）41.68±1.04 53.79±1.17 53.78±0.76 40.86±0.64 21.51±1.89 27.39±0.19 10.76±0.94 8.28±0.84 47.38±1.512）49.02±1.461）56.48±1.19 36.48±1.292）6.20±0.191.27±0.147.55±0.542）26.98±1.601）27.83±1.60 13.45±0.971）8.81±0.78 1.78±0.121）1.27±0.04 4.69±0.58 1.49±0.09 4.55±0.21 1.93±0.28 4.17±0.35 1.19±0.07 1.43±0.06 1.27±0.04 2.44±0.18 0.80±0.08 2.47±0.26 0.13±0.02 0.30±0.04 0.35±0.04 0.30±0.02 1.39±0.041）4.68±0.67 1.89±0.131）5.60±0.252）0.34±0.042）5.55±0.391）1.64±0.151）2.77±0.293）

3 讨论

NZM2410 小鼠是SLE 研究中常用的自发性红斑狼疮模型小鼠，具有典型的人类SLE 特征［5］。前期研究发现其Sle2c1rec1d1（rec1d1）亚基因座可以与Fas 基因缺陷的易感基因座lpr 协同作用，促进B6-lpr 小鼠淋巴结和脾的增大、CD3+T 淋巴细胞亚群中非典型CD3+B220+T 细胞增多以及肾脏、肺炎加重［3］。经对 rec1d1 亚基因座 DNA 全外显子测序后发现，该亚基因座仅存在Skint6基因504位核苷酸G到A 的改变，造成Skint6 基因mRNA 提前出现终止密码子，导致Skint6蛋白表达提前终止［5］。因此推测Skint6 基因突变可能是rec1d1 亚基因座的致病原因。本研究通过制备B6-Skint6M小鼠确定Skint6 突变基因突变是否为rec1d1亚基因座的致病基因。

Skint蛋白家族位于小鼠4号染色体上，包含11个Skint（Skint1~11）家族成员，胞外区与人类嗜酪蛋白家族分子同源，可调节小鼠皮肤 Vγ5Vδ1 γδT 细胞的发育和功能，多数成员表达于胸腺和皮肤，但Skint6仅表达于皮肤［6-9］。本研究结果表明，与6月龄B6-WT 小鼠相比，B6-Skint6M小鼠体质量、脾脏指数差异无统计学意义（P>0.05）。Skint6基因突变后其皮肤Skint6 mRNA 水平未见明显变化。狼疮性肾炎是SLE 最严重的并发症之一，尿蛋白是其受累的主要标志［10-12］。本研究对两组小鼠蛋白尿定量检测后发现B6-Skint6M小鼠尿蛋白含量高于B6-WT 小鼠，雄性小鼠尤为明显。因此，Skint6 基因突变可能是rec1d1 亚基因座促进B6-lpr 小鼠肾脏炎症发生的原因。

T 淋巴细胞亚群的紊乱与SLE 发生和发展关系密切［13-14］。FACS 测定及细胞计数结果表明，与B6-WT 小鼠相比，B6-Skint6M组小鼠脾脏淋巴细胞亚群中T 淋巴细胞比例及细胞绝对数明显升高，B淋巴细胞比例降低，CD3+T淋巴细胞亚群中B220+细胞即非典型CD3+B220+T 细胞亚群比例及细胞绝对数明显升高。另外，发现B6-Skint6M小鼠脾脏淋巴细胞亚群中CD4+CD44hiT 淋巴细胞，CD4+CD69+活化T细胞和Tfh比例及细胞绝对数提高，而Treg比例及细胞绝对数减少，说明体内T 细胞整体处于亢进状态，反应性明显增强。全基因组关联研究（GWAS）通过OASIS对两个SLE GWAS 数据集整合分析后确定 CD44 是 SLE 相关基因［15］。研究表明，SLE 患者 T细胞中CD44表达增加，Treg绝对数减少或功能减弱可促进 SLE 发病及疾病活动［16-17］。临床 SLE 患者中，Treg减少，而CD4+CD69+活化T细胞表达增加，导致体内免疫平衡失调，增强自身反应性T 细胞活性［18-19］。Tfh 细胞在浆细胞形成和抗体分泌过程中发挥重要作用［20］。无论是在SLE 小鼠模型中，还是SLE 患者体内，均可观察到 Tfh 细胞异常扩增［21-22］。SLE患者Tfh细胞水平和Bregs水平显著相关，Tfh细胞可促进Breg 扩增［23］。本研究亦表明B6-Skint6M小鼠脾脏中Tfh 细胞、Breg 比例及细胞绝对数明显上升。2020 年 ALEXANDE 等［24］研究表明，DNeg 数随着MRL/lpr 小鼠疾病恶化而增加，且可加剧肾脏炎症；临床小儿SLE患者DNeg数与肾脏功能也显著相关，因此DNeg 在狼疮性肾炎中起重要作用，并可能成为狼疮的标志物。本研究表明，B6-Skint6M小鼠脾脏CD3+CD4−CD8−（DNeg）细胞比例及绝对数明显增高。

综上所述，本研究初步证实Skint6 基因突变可导致小鼠脾脏淋巴细胞比例失调及免疫功能紊乱。因此认为Skint6 基因突变与小鼠SLE 发病有关，但其机制尚不明确，一种可能是Skint6 基因突变导致Skint6 表达缺失，另一种可能由于Skint6 蛋白翻译提前终止形成的分泌型肽段与免疫细胞表面某受体结合从而导致免疫细胞数量和功能变化，具体通过何种机制发挥作用尚需进一步研究。