烟台市2015-2018年人感染戊型肝炎病毒基因型分析

崔伟红，刘 娟，宫连凤，颜丙玉，徐迎春

戊型病毒性肝炎(简称戊肝，HE)是由戊肝病毒(HEV)感染引起的肝脏传染病，主要经消化道传播。近年来中国戊肝报告发病率呈逐渐上升趋势[1-3]，东部地区发病率明显高于西部和中部[4]。烟台是沿海开放城市，近年来戊肝发病率为全省平均水平的近6倍[5]，给群众造成了巨大的经济负担。HEV主要分为4个基因型，基因I和Ⅱ型仅人类感染，主要在发展中国家流行；基因Ⅲ、Ⅳ型人兽共患，以散发为主，猪是主要宿主之一，Ⅲ型世界各地均有报道，Ⅳ型主要分布于亚洲国家，尤其中国[6-8]。为了解烟台市人感染戊肝病毒流行株的基因型别，我们收集了法定传染病报告系统报告的戊肝病例，采集急性期粪便和血清标本，用套式RT-nPCR进行病毒核酸检测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择2015-2018年法定传染病报告系统报告的戊肝病例为研究对象，收集病人的基本信息。采集病例血清标本和粪便标本，血清标本进行HEV-IgM抗体检测，对HEV-IgM阳性者提取戊肝病毒RNA，进行核酸检测。共采集360份血清、48份粪便标本。

1.2 试剂 HEV-IgM抗体检测试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司生产；RNA提取试剂盒由德国Qiagen公司生产；AMV逆转录酶由美国Promega公司生产；PCR反应试剂、缓冲液由宝生物工程大连有限公司生产。实验检测委托山东省和烟台市疾病预防控制中心完成。

1.3 标本处理 粪便标本用pH7.4 PBS稀释，充分震荡混匀，制成10%悬液(w/v)，4 ℃ 3 000 r/min离心 20 min 提取上清待检；血清标本直接检测。

1.4 HEV RNA提取、扩增和测序 参考文献[9]合成HEV ORF2区域特异性引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物为：HEV外侧上游：5′-GAYGGSACYAAYACYCATATWATGGC-3′ (5 648-5 673)；HEV外侧下游：5′-GTYGGCTCGCCATTGGCYGAGAC-3′ (6 350-6 372)；HEV内侧上游：5′-GARGCWTCWAATTAYGCCCAGTAYCG -3′ (5 678-5 703)；HEV内侧下游：5′-CCAGCCGACGAAATCAATTCTGTC-3′(6 298-6 321)。

取140 μL血清或粪便悬液，用RNA提取试剂盒进行RNA提取，收集50 μL提取液。采用AMV逆转录酶，在42 ℃、50 min进行逆转录；用巢式PCR(nested PCR, nPCR)扩增HEV核苷酸片段。第一轮PCR反应：94 ℃预变性120 s；94 ℃变性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，扩增45个循环；72 ℃延伸10 min；第二轮PCR反应：94 ℃预变性120 s；94 ℃变性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

最终获得的PCR终产物序列长度为644 bp(基因组第5 678～6 321位，参考缅甸株M73218)，其中用于序列分析的区段长度为540 bp(病毒基因组第5 765～6 304位)。所有PCR阳性产物由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.5 基因序列分析 采用mega7.0对本研究所得序列和GenBank数据库下载的参考序列进行分析，计算遗传距离，并用邻接法构建基因进化树，计算Bootstrap值，检验进化树各分支置信度，进行1 000次重复运算，当Bootstrap值>70时则构建的进化树可靠。

1.6 统计学分析 采用Epidata3.0软件录入数据，用SPSS18.0软件进行统计分析。采用方差分析比较不同亚型组间数值变量差异，采用Fisher精确概率法比较不同亚型组建分类变量差异。双侧检测，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 基本情况 共采集了360份血清标本和48份粪便标本。采集的360份血清样本中，198份HEV-IgM阳性，阳性率55.00%。198份血清标本中，55份HEV核酸检测阳性，阳性率27.78%。48份粪便标本中，19份HEV核酸检测阳性，阳性率39.58%。其中2例病例血清和粪便标本同时阳性。总阳性病例数72例，男性48例，女性24例。发病3周内采集的粪便HEV核酸阳性率(57.1%)高于发病3周后采集的粪便HEV核酸阳性率(15.0%)(P=0.003)，发病3周内采集的血清HEV核酸阳性率(37.9%)高于发病3周后采集的血清HEV核酸阳性率(2.2%)(P<0.001)。见表1。

2.2 基因型分布 本次检测的72例HEV基因型全部是4型。4d亚型的构成比最高，占77.78%(56/72)；其次是4b亚型，占19.44%(14/72)；4a亚型的构成比最低，占2.78%(2/72)。采用Fisher确切概率法进行组间构成比比较，不同亚型在各年份的构成比差异无统计学意义(P=0.195)。不同亚型的季节构成差异无统计学意义(P=0.908)。不同亚型的性别构成比差异无统计学意义(P=0.132)。4a、4b、4d亚型病例的年龄分别是(50.0±7.07)岁、(57.6±9.74)岁、(58.6±10.77)岁，差异无统计学意义(F=0.667，P=0.517)；4a、4b、4d亚型病例的ALT值分别是(742.0±912.17)U/L、(1234.8±835.56)U/L、(854.9±821.97)U/L，差异无统计学意义(F=1.235，P=0.297)。见表1。

表1 2015-2018年烟台市HEVRNA检测阳性数量及分布Tab.1 Number positive and distribution of HEV RNA in Yantai from 2015 to 2018

2.3 遗传距离分析 人感染HEV核苷酸序列的遗传距离为0.002～0.303。其中4a亚型间的遗传距离是0.035；4b亚型间的遗传距离是0.015～0.127；4d亚型间的遗传距离是0.002～0.094。对72例病人和不同物种的核苷酸序列遗传距离进行分析，结果显示本次分离出的56株4d亚型HEV序列与山东地区猪源(KF176351)、羊源(KU904267)、牛源(KU904278)HEV序列的遗传距离为0.021～0.160、0.010～0.178、0.008～0.176；14株4b亚型与广西(EU676172)、广东(JX855794)、黑龙江(DQ279091)猪源HEV序列的遗传距离为0.033～0.180；2株4a亚型HEV序列与吉林(EF077630)和上海(EU366959)猪源HEV序列的遗传距离为0.060～0.226。见图1。

3 讨 论

近年来戊肝在病毒性肝炎中发病占比逐年升高[10]，开展戊肝病原学监测对于分析戊肝病毒传播路径，有效进行戊肝防控非常重要[11]。欧洲地区已经建立HEV分子监测网络，涵盖了人、动物、食品和外环境等各类来源的HEV[12]。我国也有不少学者在进行HEV分子流行病学研究。有研究显示，戊肝患者感染后2周内血清HEV RNA阳性率可高达90%左右[13]，但因戊肝早期发病不典型，病例往往症状持续一段时间才就诊，另外部分基层医院不具备诊断能力，确诊时间靠后，采集标本时往往病例已经发病较长时间，因此HEV RNA检出率不高。本研究血清标本核酸总阳性率27.78%(55/198)，高于江苏(19.2%)[14]但低于上海(32.79%)[15]的阳性率。粪便标本的核酸阳性率相对较高，达到阳性率39.58%(19/48)，可能与采集粪便样本时，仅选择了发病早期的病例有关。

研究显示，我国HEV最常见的Ⅳ型病毒，常见亚型是4a、4d和4h亚型[16]。本次检测的烟台戊肝流行株均属于第Ⅳ基因组，流行株以4d亚型(占77.78%)为主，其次是4b亚型(19.44%)，4a亚型占比最低(2.78%)。本次未在样本中检出4c亚型，山东省和烟台市以往的检测中也未曾检出4c亚型[11,17]，推测4c亚型在烟台地区不是优势株。而2012年烟台地区人源HEV主要流行株是4a亚型，其次是4d亚型[17]。说明各年份的流行优势株有差异，这与疾病的自然流行规律有关系。各年份之间的流行株并无特定的进化关系，可能与戊肝感染的多源性，高度散发有关。

国际病毒分类委员会(International Committee for Taxonomy of Viruses，ICTV) 按病毒的分子结构对 HEV 分类提出了新的建议：用氨基酸序列所建立的遗传进化树所计算出的遗传距离的大小进行基因分型[18]，当P值小于0.30为同一个基因型。本次分离出的烟台市人感染HEV核苷酸序列全部为Ⅳ型，总遗传距离为0.002～0.303，其中4a亚型间的遗传距离是0.035；4b亚型间的遗传距离是0.015～0.127；4d亚型间的遗传距离是0.002～0.094。在获得的毒株中，亲缘关系很近，但是没有完全一致的毒株，符合散发感染的特点。

分离出的4d亚型HEV序列与山东地区猪源、羊源、牛源HEV序列的遗传距离分别为0.021～0.160、0.010～0.178、0.008～0.176，表明烟台市人感染HEV序列与猪、牛、羊等动物亲缘关系均较近，提示本地HEV感染可能存在跨物种传播，动物源性传播不容忽视。一方面人感染HEV可能与进食动物制品有关[19]，也可能与HEV病毒动物粪便污染导致密切接触传播有关，尚需进一步研究。

本次的研究样本均来自于国家传染病监测网络，由于流行病学调查信息的局限性，对于肝功能仅收集了ALT指标，未进一步进行传染源的追溯，但对于追踪烟台地区HEV基因特征变化和进行人感染HEV病毒传播来源分析提供了重要的线索。

利益冲突：无

引用本文格式：崔伟红，刘娟，宫连凤，等. 烟台市2015-2018年人感染戊型肝炎病毒基因型分析[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(8)：703-706，713. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.099