HR-HPV宫颈上皮内瘤变术后miR-145、miR-135a-5p、miR-365的表达与HR-HPV转归的关系及预测价值

刘晓丽，毕 颖，王绍海，陈湘玲，唐军霞

(1.武汉市红十字会医院妇科； 2.华中科技大学附属协和医院妇科，武汉 430015)

宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)是由高危型人乳头瘤病毒(high risk human pilloma virus，HR-HPV)等引起的一种具有癌变风险的病变。故一旦检出建议对患者给予密切随访及干预[1]。物理疗法、宫颈冷刀锥切术或宫颈环形电切(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)等是CIN的主要治疗方法，但术后可能因病灶残留、自身免疫等导致HR-HPV未能转阴[2]。若HR-HPV感染持续存在，可增加CIN复发及宫颈癌恶变的危险，因此早期预测CIN术后HR-HPV感染转归对临床意义重大[3]。然而，目前临床尚缺乏预测CIN术后HR-HPV感染转归的有效方法。

微小RNA-145(micro RNA-145，miR-145)、miR-135a-5p、miR-365是一类长约22个核苷酸的分子。有研究[4-6]显示，miR-145表达在HPV感染组织中下调；浸润宫颈癌患者的miR-135a-5p表达高于HR-HPV阴性患者[5]；miR-365在宫颈癌组织中表达低于癌旁组织，并与肿瘤大小、分期等病理特征显著相关[6]。目前关于miR-145、miR-135a-5p、miR-365与HR-HPV宫颈上皮内瘤变术后HR-HPV转归关系的报道鲜见，是否会影响HR-HPV转归及是否可作为其预测标志物尚不清楚。基于以上背景，本研究探讨HR-HPV宫颈上皮内瘤变术后miR-145、miR-135a-5p、miR-365的表达与HR-HPV转归的关系及其联合预测的价值，以期为HR-HPV持续感染机制的认识及感染转归的早期预测提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年2月至2021年3月于武汉市红十字会医院和华中科技大学附属协和医院行手术治疗的98例HR-HPV CIN患者为研究对象，年龄25～55岁，平均(36.17±5.46)岁，CIN Ⅰ 23例，CIN Ⅱ 41例，CIN Ⅲ 34例。纳入标准：1)符合HR-HPV及CIN诊断标准[7]；2)行激光、微波、宫颈冷刀锥切术或LEEP等治疗者；3)自愿签署知情同意书。排除标准：1)伴免疫缺陷疾病者；2)脱落失访者；3)伴血液系统疾病者；4)既往有宫颈手术史者；5)伴急性感染类疾病者；6)伴有其他系统恶性肿瘤者。本研究经武汉市红十字会医院和华中科技大学附属协和医院伦理委员会审批，患者及直系家属自愿签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 HR-HPV转阴评估

采用实时定量聚合酶链法(RT-qPCR)检测HR-HPV表达。以术后3、6、9、12个月为门诊随访时间点，以上任意连续2个时间点HR-HPV表达阴性视为转阴(转阴组)；若术后 12 个月仍未达到以上标准，则定义为持续感染(未转阴组)。

1.2.2 资料收集

采用一般资料调查表收集2组年龄、孕次、体重指数(BMI)、产史、CIN分期、手术方法、HR-HPV感染数量和分型。资料收集由经过培训的调查员实施。

1.2.3 miR-145、miR-135a-5p、miR-365表达的检测

取活检或术中切除的CIN标本，采用RT-qPCR法检测组织标本中miR-145、miR-135a-5p、miR-365表达。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃预变性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，40个循环，基因的表达水平以相对U6作为内参。各基因引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.3 观察指标

1)比较2组一般资料；2)比较2组CIN组织中miR-145、miR-135a-5p、miR-365的表达；3)分析影响术后HR-HPV转阴的因素；4)分析miR-145、miR-135a-5p、miR-365对HR-HPV转阴的预测价值；5)分析不同miR-145、miR-135a-5p、miR-365表达者术后持续感染的危险度。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 2组一般资料比较

术后3、6、9、12个月门诊随访时间点结果显示，转阴组48例(48.98%)，未转阴组50例(51.02%)。2组在年龄、孕次、BMI、产史、CIN分期、手术方法、HR-HPV感染数量和分型上差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。见表2。

表2 2组一般资料比较

2.2 2组miR-145、miR-135a-5p、miR-365表达比较

RT-qPCR结果显示，未转阴组的miR-145、miR-365表达低于转阴组，miR-135a-5p表达高于转阴组(均P<0.05)。见表3。

表3 2组组织中miR-145、miR-135a-5p、miR-365表达比较

2.3 术后HR-HPV转阴的多因素Logistic回归分析

以HR-HPV转阴情况为结局因变量(转阴=0，未转阴=1)，miR-145、miR-135a-5p、miR-365作为自变量(均按实际值赋值)，结果显示，miR-145、miR-365是转阴的保护因素，miR-135a-5p是转阴的危险因素(均P<0.05)。见表4。

表4 术后HR-HPV转阴的多因素Logistic回归分析

2.4 miR-145、miR-135a-5p、miR-365对HR-HPV转阴的预测价值

三者联合检测预测HR-HPV转阴的AUC大于三者单独检测。见图1和表5。

表5 miR-145、miR-135a-5p、miR-365预测HR-HPV转阴的ROC分析

100-特异性/%

2.5 术后持续感染的危险度

以2.4中ROC分析获得的最佳截断值为分界标准，将患者分为miR-145、miR-135a-5p、miR-365表达高水平和低水平，结果显示，miR-145、miR-365高水平者持续感染风险分别是低水平者的0.449、0.465倍，miR-135a-5p高水平者持续感染风险是低水平者的3.712倍(均P<0.05)。见表6。

表6 不同miR-145、miR-135a-5p、miR-365表达者术后持续感染的危险度分析

3 讨论

CIN术后部分HR-HPV患者并非即刻转阴，而是随着时间推移逐渐转阴。ZHANG等[8]报道，年长CIN患者术后HR-HPV转阴率低于年轻患者，提示年龄是影响HR-HPV转阴情况的因素。本研究在所纳入患者年龄、CIN分期等一般资料均衡可比前提下发现，未转阴组miR-145、miR-365表达低于转阴组，miR-135a-5p表达高于转阴组，提示miR-145、miR-135a-5p、miR-365与HR-HPV感染转归有关。

微小RNA是一类非编码单链RNA分子，因可参与转录后基因表达调控，成为近年来多个领域研究的热点。根据既往资料[9]，微小NRA的调节功能参与了导致宫颈癌和对病毒感染反应的所有过程，致癌HR-HPV感染会诱导许多细胞微小RNA的异常表达。miR-145可调控多种肿瘤细胞的生长、侵袭，高表达miR-145对原癌基因激活具有明显抑制作用[10]。YU 等[11]报道，与健康人相比，HPV感染者miR-145降低，提示miR-145与HPV感染有关，但在HR-HPV感染临床转归中所扮演角色尚不明确。本研究发现，与术后转阴患者比较，未转阴患者miR-145降低，是转阴的保护因素。在尖锐湿疣组织中，用miR-145模拟物上调miR-145表达后，尖锐湿疣组织细胞增殖减少，凋亡增加，而敲除miR-145后，HPV感染的尖锐湿疣组织细胞凋亡显著减少[12]。孙依娜等[13]利用第二代杂交捕获法对HPV-DNA进行分型，发现宫颈癌组织中miR-145表达与HPV感染、HPV E6/E7 mRNA呈负相关，提示miR-145高表达对HR-HPV感染具有抑制作用，本研究结果与之相似。miR-145高水平者持续感染风险是低水平者的0.449倍，亦证实了miR-145的保护因子作用。miR-145抑制HR-HPV感染的机制目前尚未完全阐明。结合既往资料[14]，miR-145甲基化是通过靶向核小体结合的DNA甲基转移酶3影响HR-HPV感染的，但是否还有其他机制仍需深入论证。

miR-135a-5p在结直肠癌等癌组织中表达高于癌旁组织，与癌细胞增殖、侵袭、凋亡有关[15]。王亦如等[16]发现，宫颈癌组织miR-135a-5p表达高于正常宫颈组织。本研究显示，miR-135a-5p在未转阴患者中表达高于转阴患者，是转阴的危险因素，因此对组织中miR-135a-5p表达水平较高患者，应加强随访和管理，警惕其发生HR-HPV持续感染的风险。陈丹霞等[17]采用二代测序方法筛选出微小RNA进行稳定性分析，发现HPV16和(或)HPV18感染患者miR-135a-5p呈高表达。miR-135a-5p高表达能通过调控细胞上皮-间充质转化、糖代谢等途径，阻碍肿瘤细胞侵袭抑制因子合成，为HR-HPV的增殖及病情进展创造有利微环境，从而影响HR-HPV感染的临床转归[18]。同时，miR-135a-5p还能通过作用于张力蛋白同源物、Akt/mTOR信号通路，介导HR-HPV持续感染[19]。本研究结果发现，miR-135a-5p高水平者持续感染风险是低水平者的3.712倍，表明miR-135a-5p高表达会增加术后HR-HPV持续感染风险。另外在单一指标中，miR-135a-5p预测术后HR-HPV转阴的AUC最大，表明检测miR-135a-5p能为临床早期预测患者HR-HPV感染转归提供参考。

miR-365是微小RNA家族中一个重要成员，已被证实在多种肿瘤组织中存在miR-365表达的异常。郭颖等[20]通过比较发现，miR-365在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组织中表达随着病理分级增加而逐渐降低。本研究发现，miR-365表达降低与CIN患者术后HR-HPV感染未转阴有关，可作为早期预测HR-HPV感染转归的分子标志物。结合既往报道[21]，miR-365是通过调节G1/S-特异性周期蛋白-D1，影响细胞增殖分化周期机制发挥作用的。但COON等[22]报道，miR-365在口腔鳞状细胞癌中表达升高，并能介导癌细胞增殖、侵袭，提示miR-365起到消极因子作用，与本研究获得的miR-365是保护因素结果不同，这可能是miR-365在不同疾病中发挥调节作用的机制不同导致的，提示miR-365调控机制复杂，不同疾病不具有机制共享作用，所以不同情况应分别进行针对性研究。

本研究结果还发现，miR-145、miR-135a-5p、miR-365在预测CIN术后HR-HPV感染转归中呈现出不同的应用价值，其中单独应用时miR-135a-5p预测价值最高，其次是miR-365、miR-145，但均低于miR-145、miR-135a-5p联合miR-365预测HR-HPV转阴的AUC，故三者联合检测能提高预测价值，从而为临床提供更可靠的参考数据，这可能是三者均与HR-HPV感染转归有关，而联合检测囊括了HR-HPV感染更多的机制，所以联合检测预测价值更高。值得注意的是，受研究时间、病例、经费等影响，本研究将随访时间定为12个月，而在术后更长久的时间中，各指标与HR-HPV感染转归定量关系是否还符合这一规律仍不明确，这是本研究局限所在，有待后续延长随访时间来深入探讨。

综上所述，miR-145、miR-365表达降低和miR-135a-5p表达升高，与CIN术后HR-HPV感染转归情况密切相关，联合检测可作为早期预测HR-HPV感染转归的有效方案，可为临床提供重要参考。