不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内解毒酶活性的影响

刘广娜，王嘉辰，李欣诺，付雅琪

（吉林农业科技学院中药学院，吉林 132109）

人参（Panax ginsengC.A.Meyer）属五加科人参属多年生药用植物[1]。人参皂苷是人参的主要活性成分，具有多种药理作用[2]。蛴螬是鞘翅目金龟总科幼虫的统称，为地下害虫中危害最严重的一大类群，主要以土壤中的腐殖质、植物根茎为食，对花生、小麦、大豆、马铃薯和玉米等农作物危害比较严重[3]。目前蛴螬防治主要以化学防治为主，例如使用氟虫腈、辛硫磷、吡虫啉等[4]。研究表明昆虫抗药性的产生主要是通过调节体内解毒酶，例如多功能氧化酶（MFO）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）活性来增强其对杀虫剂的代谢能力[5-8]。过度使用化学农药，不仅会使蛴螬产生抗药性，还会对人类健康和环境造成威胁。因此，本研究用人参根总皂苷处理3龄蛴螬，采用载毒叶碟法[9-10]和酶标法[11]，研究人参根总皂苷处理蛴螬的最佳时间和最佳浓度，为合理有效使用杀虫剂，及发展新型生物农药防治害虫提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：人参根总皂苷（纯度80%）购于上海源叶生物科技有限公司，用1‰曲拉通配制成浓度为5、10、20、30、60 mg/mL人参根总皂苷溶液；3龄蛴螬购于活体蛴螬专卖店（辽宁葫芦岛自然野生绿色馆），新鲜土豆片饲养备用；土豆购于超市，使用前清水浸泡去除可能存在的农药残留。

供试试剂：EDTA（乙二胺四乙酸），上海迈瑞尔化学技术有限公司；PTU（苯基硫脲），上海百舜生物科技有限公司；SDS（十二烷基硫酸钠）、毒扁豆碱，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘油，上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇，北京雷根生物技术有限公司；牛血清蛋白，上海迈瑞尔化学技术有限公司；DTT（二硫代苏糖醇）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、CDNB（1-氯-2,4-二硝基苯）、GSH（还原型谷胱甘肽）、丙酮、P-NA（对硝基苯甲醚）、固兰B盐、考马斯亮蓝G-250，上海源叶生物科技有限公司；酶提取缓冲液为0.1 mol/L pH 7.8 PBS（含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF、10%甘油）。

供试仪器：Hitachi×CT15E高速冷冻离心机，上海妙生科贸有限公司；SpectraMaxPlus384酶标仪，美谷分子仪器上海有限公司；SZB全自动制冰碎冰机，常熟市菱科电器有限公司；TopPette移液器，北京同德创业科技有限公司；JY2002电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试虫试验 采用载毒叶碟法[9-10]。挑选状态活跃的蛴螬，饥饿处理6 h。试验以浓度为5、10、20、30、60 mg/mL的人参根总皂苷溶液完全浸泡土豆片进行处理，以1‰曲拉通溶液浸泡土豆片作为对照（CK）。浸泡3 s后取出，自然挥发土豆片表面水分置于培养皿中，将饥饿处理的蛴螬置于土豆片表面，每皿10头，每个处理重复3次，室温避光饲养24、48 h后进行酶源制备。

1.2.2 酶源制备 将上述试虫解剖取中肠，用酶对应的PBS提取液在冰浴条件下充分研磨，将研磨匀浆转移至离心管中，用酶提取缓冲液定容至2 mL、4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

1.3 项目测定

1.3.1 蛋白含量测定 在酶标板中依次加入5 μL浓度为0、50、100、200、400、800 μg/mL的牛血清蛋白稀释液，200 μL考马斯亮蓝G-250试剂，重复3次。放置5 min后，于595 nm处测定OD值，回归方程y=0.000 3x+0.230 2，R2=0.990 6。测定酶液中蛋白含量时，将酶液作为反应液，加入考马斯亮蓝试剂混匀，室内放置5 min，用酶标仪于595 nm处测定OD值，并计算蛋白含量。绘制蛋白含量标准曲线，如图1。

图1 蛋白含量标准曲线绘制

1.3.2 蛴螬多功能氧化酶（MFO）活性测定 27 ℃下在酶标板中依次加入4 mol/L P-NA 100 μL、酶源90 μL、9.6 mmol/L NADPH 10 μL。使用酶标仪于405 nm处测定OD值，每1 min取值一次，酶反应30 min。多功能氧化酶比活力=，单位（μmol/mg/min）。式中，V为酶源总体积（mL），Pr为蛋白含量（mg/mL），T为反应总时间（min）。

1.3.3 蛴螬谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）活性测定 在离心管中依次加入1.2 mL 66 mmol/L pH 7.4 PBS，0.15 mL 50 mmol/L GSH，0.05 mL 0.03 mol/L CDNB及0.1 mL酶液。混匀加入酶标板后，于340 nm处测定OD值，每1 min取值一次，酶反应5 min，谷胱甘肽-S-转移酶比活力公式同MFO比活力，单位（μmol/mg/min）。

1.3.4 蛴螬羧酸酯酶（CarE）活性测定 在离心管中依次加入0.3 mmol/L CDNB、0.04 mol/L pH 7.0 PBS酶液，放入摇床中30 ℃震荡30 min，立即加入285 μL显色液。吸取250 μL注入96孔酶标板中，于600 nm处测定OD值。每1 min取值一次，酶反应5 min，羧酸酯酶比活力公式同MFO比活力，单位（μmol/mg/min）。

1.4 数据分析

用Micorsoft Excel 2016和SPSS 18.0软件统计分析试验数据，用LSD法对统计结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内多功能氧化酶（MFO）活性的影响

以人参根总皂苷浓度为横坐标，MFO比活力均值为纵坐标，计算MFO比活力，分析处理时间为24 h和48 h时二者相关关系。由图2可知，处理时间为24 h时，处理蛴螬体内MFO比活力显著低于对照（CK），且人参根总皂苷浓度为20mg/mL时，抑制作用最强，MFO比活力达到最低，比CK下降45%。处理时间为48 h时，蛴螬体内MFO比活力呈现低浓度抑制、中浓度诱导、高浓度显著抑制的现象。为了确定处理时间为24 h和48 h时，不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内MFO比活力的影响是否存在显著性差异，进行了方差分析和多重比较。处理时间为24 h时，人参根总皂苷浓度为20 mg/mL的处理与CK和人参根总皂苷浓度为60 mg/mL的处理存在显著性差异，CK与人参根总皂苷浓度为5、10、30、60 mg/mL的处理差异不显著。处理时间为48 h时，除人参根总皂苷浓度为60 mg/mL的处理与各处理存在显著性差异，其余处理对蛴螬体内MFO比活力的影响差异不显著。结果表明，人参根总皂苷能够抑制蛴螬体内MFO比活力，且抑制作用显著。最佳处理时间为24 h，最佳人参根总皂苷浓度为20 mg/mL。

图2 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内MFO活性的影响

2.2 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）活性的影响

以人参根总皂苷浓度为横坐标，GSTs比活力均值为纵坐标，计算GSTs比活力，分析处理时间为24 h和48 h时二者相关关系。由图3可知，人参根总皂苷处理时间为24 h和48 h时，对蛴螬体内GSTs比活力抑制作用显著。在处理时间为24 h、人参根总皂苷浓度为10 mg/mL时，MFO比活力达到最低，比CK下降42%。处理时间为48 h、人参根总皂苷浓度为60 mg/mL时，蛴螬体内MFO比活力比CK下降30%。为了确定处理时间为24 h和48 h时，不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内MFO比活力的影响是否存在显著性差异，进行了方差分析和多重比较。处理时间为24 h时，人参根总皂苷浓度为60mg/mL的处理与CK差异不显著，但与其余处理差异显著。处理时间为48 h时，人参根总皂苷浓度为20、60 mg/mL的处理与CK和人参根总皂苷浓度为10 mg/mL的处理存在显著性差异，人参根总皂苷浓度为5 mg/mL的处理与CK存在显著性差异。结果表明，人参根总皂苷能够抑制蛴螬体内GSTs比活力。最佳处理时间为24 h，最佳人参根总皂苷浓度应低于60 mg/mL。

图3 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内GSTs活性的影响

2.3 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内羧酸酯酶（CarE）活性的影响

以人参根总皂苷浓度为横坐标，CarE比活力均值为纵坐标，计算CarE比活力，分析处理时间为24 h和48 h时二者相关关系。由图4可知，人参根总皂苷处理时间为24 h时，中浓度人参根总皂苷对蛴螬体内GSTs比活力抑制作用显著。人参根总皂苷浓度为30 mg/mL时，MFO比活力比CK下降44%。处理时间为48 h时，人参根总皂苷对蛴螬体内MFO比活力具有诱导作用。为了确定处理时间为24 h和48 h时，不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内MFO比活力的影响是否存在显著性差异，进行了方差分析和多重比较。处理时间为24 h时，人参根总皂苷浓度为20、30 mg/mL的处理与人参根总皂苷浓度为5、60 mg/mL的处理差异显著，人参根总皂苷浓度为5 mg/mL的处理与人参根总皂苷浓度为10 mg/mL的处理差异显著。处理时间为48 h时，人参根总皂苷浓度为10、60 mg/mL的处理与人参根总皂苷浓度为5、30 mg/mL的处理差异显著，人参根总皂苷浓度为30 mg/mL的处理与CK差异显著。结果表明，处理时间为24 h、人参根总皂苷浓度为30 mg/mL时抑制作用最强。

图4 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内CarE活性的影响

3 结论与讨论

近年来对人参皂苷在药理、化学成分等方面的研究已较为深入，但是对蛴螬体内解毒酶活性的影响鲜有报道。本研究通过载毒叶碟法研究不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内各解毒酶的影响。多功能氧化酶（MFO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）均是昆虫体内重要的解毒酶，其活力大小决定了昆虫解毒能力的强弱，也是昆虫产生抗药性的重要机制。因此通过抑制其活性来降低昆虫的解毒能力，是提高昆虫死亡率的有效措施。中国作为农业大国，防治昆虫造成农作物的损失刻不容缓。物理防治和化学药剂防治均是防治农业害虫的主要手段，但长期使用化学药剂的危害显而易见，故生物防治终将成为国内外科研人员研究的方向。印楝素、蛇床子、山苍子、苦皮藤等是应用较为成功的生物源杀虫剂，其它的新型植物源物质也在不断发掘。王天宇[12]研究发现蛇床子素对米象和麦蛾均有较强的毒杀作用，且毒杀效果随着处理剂量的增加而显著增强。王爱玉等[13]得出苦参碱对烟蓟马的毒力灵敏度高，可用于防控棉田烟蓟马。黄训兵等[14]研究得出芦丁、单宁酸、烟碱和苦参碱4种植物源化合物对亚洲小车蝗3龄蝗蝻的绿色防控和生物农药开发方面均具有一定潜力。王振越[15]用杨树中主要次生物质黄酮饲喂舞毒蛾幼虫，通过生长发育及取食试验测定发现黄酮具有强拒食性。

随着研究深入，学者发现不同植物次生代谢物可能对植食性昆虫体内不同的解毒酶具有抑制或诱导作用。潘忠玉[16]在研究0.500%绿原酸饲养美国白蛾5龄幼虫中得出，不同时间处理下，0.500%绿原酸对GSTs比活力产生先诱导后抑制的作用，处理时间在36 h前处于诱导作用，在36 h后则为抑制作用。李海涛等[17]在研究人参单体皂苷对桃蚜体内解毒酶活性的影响中，得出人参单体皂苷Rb1对MFO活性也产生了先诱导后抑制的作用。

本研究初步表明，人参根总皂苷处理时间为48 h时对蛴螬体内MFO比活力呈中浓度诱导，高浓度抑制的趋势；人参根总皂苷各处理浓度在处理时间为24 h和48 h时，对蛴螬体内GSTs比活力均呈抑制作用；而人参根总皂苷在处理时间为24 h时，对蛴螬体内CarE比活力呈低浓度诱导，高浓度抑制的趋势。总体而言，人参根总皂苷处理浓度为中浓度（20、30 mg/mL），处理时间为24 h时，对蛴螬体内MFO、GSTs、CarE比活力抑制作用显著。为了更好地研究其作用机理，还应扩大作用时间和处理浓度的范围，并增加精确摄入量测定。同时，补充载毒叶碟法下昆虫营养指标、生长发育、致死率，其它解毒酶、消化酶系等指标的研究。在倡导绿色农业的大环境下，与其它杀虫剂配合使用以达到协同效应是未来新型植物源农药发展的方向，本研究可为其进一步深入研究提供一定的依据。