蒲公英提取物对LPS诱导小鼠乳腺炎的减轻效应及其机制分析

赵 欣，王 莹，李春亭，王 巍，桑 锐，李海涛,2*，张雪梅*

(1.延边大学农学院，延吉 133002；2.中国农业科学院特产研究所，长春130112)

乳腺炎是乳腺组织因病原微生物侵害、化学性刺激、机械性损伤以及饲养管理不当等不良条件刺激下所引发的炎症性疾病。奶牛发生乳腺炎后可导致牛乳产量及乳品质大幅下降，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。内毒素(lipopolysaccharide，LPS)是大肠杆菌等革兰阴性菌细胞壁的主要成分，也是该类病原最强的致病因子之一。Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)是LPS的模式识别受体，LPS能够激活TLR4引起其下游核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信号通路活化，释放大量促炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)，白细胞介素-1β(interleukin-1β，1L-1β) 和白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)，从而刺激机体导致炎症发生。

目前，奶牛乳腺炎临床治疗主要以抗生素为主，抗生素在奶牛乳腺炎发病初期或急性发作时有明显的治疗效果，能够抑制或杀灭病原微生物。但是抗生素的大量使用容易产生耐药性、药物残留和毒副作用等不良反应。蒲公英()又名婆婆丁、黄花地丁、黄花苗等，是一种多年生菊科草本植物。药理学研究表明，蒲公英性味甘平、无毒，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，有“天然抗生素”之美称。因此，本试验通过建立LPS诱导的小鼠乳腺炎模型，研究蒲公英提取物对小鼠乳腺炎是否有减轻效应及其机制，为蒲公英的临床开发及利用提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF级 ICR孕鼠，8 周龄，体质量30 g±2 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。小鼠饲养于独立通风笼盒，自由饮食、饮水，适应性饲养1周 后开始试验期。

1.2 主要试剂

LPS购自Sigma公司，地塞米松(dexamethasone，DEX)注射液购自山东鲁抗公司，TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒购自Biolegend公司，MPO检测试剂盒购自南京建成研究所，RIPA裂解液和PMSF均购自碧云天公司，β-Actin购自Santa Cruz公司，兔抗鼠p65、p-p65、IκBα、p-IκB抗体购自CST公司，TLR4抗体购自Abcam公司，兔抗鼠p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK抗体、山羊抗兔IgG二抗购自Santa Cruz公司。

1.3 主要仪器

Miniframs转印仪、IMARK酶标仪(美国伯乐)，JY600电泳仪，B15-3数显恒温磁力搅拌器，FA135S电子分析天平，E-Gel Imager凝胶成像分析仪，3-30k低温高速离心机。

1.4 蒲公英提取物的制备

蒲公英全草购自延吉同仁堂大药房，提取方法同本实验室之前的报道。即取蒲公英全草，蒸馏水浸泡过夜，煎煮3次(分别3、1、1 h)，过滤，合并滤液，使用旋转蒸发仪将滤液反复减压蒸馏，控制温度在45 ℃，转速50 r·min，蒸发后离心30 min，取上清液低压冻干，试验前加蒸馏水配制成高、中、低剂量。

1.5 试验动物分组与给药

母鼠分娩后泌乳5～7 d，将ICR母鼠随机分为空白组(CG)、模型组(MG)、阳性组(DEX)及蒲公英提取物高、中、低剂量组(10.0、5.0、2.5 g·kg)，每组10只，蒲公英提取物高、中、低剂量组按照0.2 mL·只灌胃给药，连续给药6 d，2次·d，空白组灌胃等体积生理盐水，阳性组于建模后6 和12 h腹腔注射5 mg·kgDEX。

1.6 小鼠乳腺炎模型的建立

于末次给药1 h后，除空白组外其余各组小鼠腹腔注射适量10%乌拉坦进行麻醉，依照文献报道建模。对第4对乳房消毒后，充分暴露乳头，用无菌眼科剪剪去乳头最尖端0.5 mm，使乳导管充分暴露，采用微量进样器，于乳房基部灌注50 μL 0.2 mg·mL的LPS悬液，空白组小鼠按同样方法进行麻醉，暴露乳导管后采用微量进样器于乳房基部灌注50 μL的生理盐水。

1.7 ELISA法测定细胞因子的含量

建模24 h后，将各组小鼠取血，分离血清，ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具体操作按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒说明书进行。

1.8 小鼠血清中MPO的测定

建模24 h后，将各组小鼠取血，分离血清，与血清稀释液按1∶1比例稀释，充分混匀制成混合液，之后的操作按照MPO试剂盒说明书进行。

1.9 HE染色法观察乳腺组织病理变化

取10%中性福尔马林固定的小鼠部分乳腺，流水冲洗24 h，置于生物组织机脱水，待脱水结束后进行组织块包埋，随后用石蜡切片机进行切片，切片厚度为0.5 μm，使用摊片机摊于洁净载玻片上，置于烘片机烘片后,进行HE染色以及松节油封固，镜下观察。

1.10 Western blot法检测乳腺组织中相关信号通路蛋白表达

应用RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取小鼠乳腺组织蛋白，应用 BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，之后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，TBST洗3次，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗3次，加一抗(TLR4，p65、IκB、p38、JNK、ERK、p-p65、p-IκB、p-p38、p-JNK、p-ERK)4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加山羊抗兔IgG二抗室温孵育1 h，TBST洗3次后，加入ECL显色液后放入显影仪中进行显影拍照并保存。

1.11 数据处理与分析

2 结 果

2.1 蒲公英提取物对LPS诱导的乳腺炎小鼠血清中细胞因子的影响

由图1可知，模型组与空白组相比，血清中TNF-α、IL-1β和IL-6表达量升高，差异极显著(<0.01)。 蒲公英提取物高、中剂量组与模型组相比，极显著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量(<0.01)；蒲公英提取物低剂量组与模型组相比，极显著降低血清中TNF-α和IL-6的表达量(<0.01)， 显著降低血清中IL-1β的表达量(<0.05)。DEX也极显著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量(<0.01)。

与空白组比较，##.P<0.01；与模型组比较，*.P<0.05，**.P<0.01。下同Compared with blank group, ##.P<0.01; Compared with model group, *. P<0.05, **. P<0.01. The same as below图1 蒲公英提取物对小鼠血清中细胞因子的影响Fig.1 Effect of dandelion extract on serum cytokines in mice

2.2 蒲公英提取物对LPS诱导的乳腺炎小鼠血清中MPO的影响

由图2可知，模型组与空白组相比，小鼠血清MPO的含量上调，差异极显著(<0.01)。蒲公英提取物高、中剂量组与模型组相比，极显著降低血清中MPO的含量(<0.01)；蒲公英提取物低剂量组与模型组相比，显著降低血清中MPO的含量(<0.05)。DEX也极显著降低血清中MPO的含量(<0.01)。

图2 蒲公英提取物对小鼠血清中MPO的影响Fig.2 Effect of dandelion extract on serum MPO in mice

2.3 蒲公英提取物对LPS诱导的乳腺炎小鼠乳腺病理变化的影响

HE 染色结果显示：空白组小鼠乳腺组织具有正常的结构，未出现病理变化(图3A)。模型组小鼠乳腺组织发生了明显的病理变化，主要表现为乳腺内有大量炎性细胞和渗出物浸润(图3B)。与模型组比较，蒲公英提取物高、中剂量组明显减轻了乳腺腺泡内炎性细胞浸润程度，仅存在少量渗出物；蒲公英提取物低剂量乳腺腺泡内存在一定数量的炎性细胞和渗出物(图3D～F)。阳性组小鼠乳腺细胞形态基本正常，乳腺腺泡内存在少量渗出物(图3C)。

A.空白组；B.模型组；C. 阳性组；D. 蒲公英提取物高剂量组；E. 蒲公英提取物中剂量组；F.蒲公英提取物低剂量组。箭头为小鼠乳腺腺泡结构A. CG； B. MG； C. Positive group； D. Dandelion extract high-dose group； E. Dandelion extract medium-dose group；F. Dandelion extract low-dose group. Arrow shows the acinar structure of mouse mammary gland图3 蒲公英提取物对小鼠乳腺病理变化的影响Fig.3 Effect of dandelion extract on pathological change of mastitis in mice

2.4 蒲公英提取物对LPS诱导的乳腺炎小鼠TLR4蛋白的影响

通过Western blot方法检测LPS诱导的乳腺炎小鼠TLR4蛋白的表达。由图4可知，模型组与空白组相比，TLR4蛋白的表达水平极著显上调(<0.01)。 蒲公英提取物高、中、低剂量组与模型组相比，极显著下调TLR4蛋白的表达水平(<0.01)。DEX也极显著下调TLR4蛋白的表达水平(<0.01)。

图4 蒲公英提取物对小鼠TLR4蛋白表达的影响Fig.4 Effect of dandelion extract on TLR4 protein expression in mice

2.5 蒲公英提取物对LPS诱导的乳腺炎小鼠NF-κB 信号通路的影响

通过Western blot方法检测IκB和p65蛋白的磷酸化水平，探究蒲公英提取物对NF-κB信号通路激活情况。由图5可知，模型组与空白组相比，IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表达水平极显著上调(<0.01)，IκB和p65蛋白的表达水平极显著下调(<0.01)；蒲公英提取物高、中剂量组与模型组相比，极显著下调IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表达水平(<0.01)，蒲公英提取物低剂量组与模型组相比，显著下调IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表达水平(<0.05)。DEX也极显著上调IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表达水平(<0.01)。

图5 蒲公英提取物对小鼠NF-κB信号通路的影响Fig.5 Effect of dandelion extract on NF-κB signaling pathway in mice

2.6 蒲公英提取物对LPS诱导的乳腺炎小鼠MAPKs信号通路的影响

通过Western blot法检测p38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平，探究蒲公英提取物对MAPKs信号通路影响。由图6可知，模型组与空白组相比，p38、JNK和ERK磷酸化蛋白的表达水平极显著上调(<0.01)； 蒲公英提取物高、中剂量组与模型组相比，p38、JNK和ERK磷酸化蛋白的表达水平极显著下调(<0.01)，蒲公英提取物低剂量组与模型组相比极显著下调p38和ERK磷酸化蛋白的表达水平(<0.01)，显著下调JNK磷酸化蛋白的表达水平(<0.05)。DEX也极显著下调p38、JNK和ERK磷酸化蛋白的表达水平(<0.01)。

图6 蒲公英提取物对小鼠MAPKs信号通路的影响Fig.6 Effect of dandelion extract on MAPKs signaling pathway in mice

3 讨 论

奶牛乳腺炎是由于感染病原体、损伤、过敏或肿瘤引起的乳腺实质炎症，具有发病率高、致病因素种类繁多等特点，给畜牧业和乳制品行业造成重大的经济损失，并且所引发的食品安全问题也威胁着人类的身体健康。DEX是临床上常用的甾体抗炎药物，在本试验中将其作为阳性药物使用，但其易产生严重的不良反应，因此寻找有效、安全的天然替代品。蒲公英的抗炎作用已在现代药理学研究中得到了证实，主要应用于治疗乳腺炎、胃肠炎、肝炎等疾病。大肠杆菌是乳腺炎最主要的病原之一，LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，乳导管灌注LPS所建立的小鼠乳腺炎模型与临床上由大肠杆菌感染所引起的奶牛乳腺炎具有相同的症状，可用于乳腺炎发病机制的探索以及防治药物的筛选。因此本试验通过LPS诱导建立小鼠乳腺炎模型，探究蒲公英提取物对乳腺炎是否有减轻作用及其机制。

LPS灌注乳腺导管后，在细胞膜各种相关受体的作用下激活一系列的信号转导通路，进而释放炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等。由巨噬细胞或乳腺上皮细胞产生的TNF-α可以诱导中性粒细胞浸润和活化，损害血管内皮细胞，上调细胞黏附分子，促进氧自由基的分泌，启动和加重其他炎症介质的级联反应。IL-6是LPS诱导机体发烧的基本介质，并且对白细胞有趋化作用使其进入感染部位，加剧炎症反应过程。在炎性应答中，IL-1β 调节的内皮细胞黏附素的表达导致感染中嗜中性粒细胞的趋化作用。Nakajima等的研究发现，在自然感染的乳腺炎中，血清和乳汁中的TNF-α和IL-6表达量显著升高。因此抑制这些炎性细胞因子可以减轻乳腺炎的危害。本试验结果表明，蒲公英提取物高、中剂量组可显著抑制LPS诱导的乳腺炎小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。Liu等研究了蒲公英提取物对骨骼肌细胞增殖和减轻LPS诱导的炎症反应的影响，结果显示，蒲公英提取物显著降低LPS诱导的大鼠骨骼肌细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，与本试验结果一致。MPO 主要由中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞等合成释放，也是衡量乳腺炎水平的关键指标。本试验中小鼠经LPS诱导后血清中MPO含量显著升高，随着蒲公英提取物给药剂量增加显著降低了小鼠血清中MPO含量。

HE染色法可显示组织正常和病变的一般形态结构，本试验采用HE染色法观察蒲公英提取物对小鼠乳腺组织损伤影响的情况。本研究中LPS可以引起小鼠乳腺腺泡腔内聚集大量的炎性细胞和渗出物等病理变化，该结果与唐鑫和欧爱群等的研究结果相一致，表明小鼠乳腺炎模型构建成功。本试验随着蒲公英提取物给药剂量增加，明显减轻了由LPS诱导的乳腺炎小鼠乳腺病理变化。

TLR4可识别来自革兰阴性菌的LPS。LPS通过TLR4受体，与TLR4结合并激活NF-κB，进而导致促炎性细胞因子的生成，LPS经MyD88依赖性途径参与炎症免疫反应，是调控NF-κB和MAPKs的重要途径。本研究中，随蒲公英提取物给药剂量升高明显减轻由LPS灌注引起乳腺组织中TLR4的表达。NF-κB信号通路被认为是激活炎症基因表达从而产生炎症表型变化的关键参与者，抑制NF-κB激活可以减轻LPS诱导的乳腺炎症。Chen等通过建立了LPS诱导的小鼠乳腺炎模型探究了荷叶碱对乳腺炎的保护作用，得出荷叶碱通过抑制了TLR4-NFκB信号通路，对小鼠乳腺炎的保护起到了作用。MAPKs信号通路主要包含P38激酶、c-Jun N末端激酶(JNK)和3种细胞外调节蛋白激酶(ERK)，是信号从细胞表面传递到细胞核的内部的重要途径。ERK活化后，可进一步带动其下游底物的激活，进而通过对下游蛋白的调控参与细胞的生长、增殖、免疫和存活等一系列生物学过程，JNK可以调节细胞的增殖、抗炎和凋亡，p38在氧化应激细胞的炎症反应、衰老、凋亡、免疫调节等多种生理反应过程中起重要作用。JNK 和 p38 的性质相似，都属于应激启动的蛋白激酶。Zhang等发现LPS可以显著激活MAPKs信号通路诱导乳腺炎发生，白藜芦醇预防后p38和ERK被显著抑制。这些结果说明MAPKs信号通路在LPS诱导的奶牛乳房炎中发挥重要的作用。本研究中蒲公英提取物高、中剂量组极显著抑制NF-κB和MAPKs信号通路的过度激活，从而减少炎性细胞因子的表达。

4 结 论

蒲公英提取物能够降低LPS诱导的乳腺炎小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和 IL-6的分泌及MPO的含量，减轻乳腺组织病理变化，抑制TLR4蛋白的表达，下调NF-κB和MAPKs通路中相关蛋白的表达，表明蒲公英提取物通过调控NF-κB和MAPKs信号通路对LPS诱导的小鼠乳腺炎具有减轻作用。