早胜牛CD36基因第9外显子多态性及不同组织mRNA表达分析

王燕燕，徐建峰，高 博，董 和，石福岳，容维中*，张艳丽，李振明

(1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000；2.平凉市农产品质量安全检测检验中心，甘肃 平凉 744000；3.宁县畜牧兽医局，甘肃 宁县 745200)

早胜牛，又称“早胜东牛”，主要生活在地处陇东黄土高原的庆阳市早胜塬上，是经当地群众长期选育而成的地方品种，也是甘肃省仅有的大型黄牛品种，属于我国五大黄牛品种之一。早胜牛体格大，体力强，役用肉用性能好，是当地农业生产的重要役畜，深受当地群众喜爱。近年来，随着人们生活水平的逐渐提高，对牛肉的需求与日俱增，2019年我国牛肉消费量约为833×10t，人均牛肉消费量达5.95 kg，因此如何提高早胜牛的肉用性能是当前人们最关注的问题。

脂肪酸转位酶(CD36)是一糖基化程度较高的单链糖蛋白，也是一种多配体B类清道夫受体，主要介导细胞长链脂肪酸(LCFAS)的摄取。36具有多种功能，其主要功能是参与脂类代谢，主要与代谢综合征、糖尿病、阿尔兹海默症等多种脂类代谢疾病相关，与动物的脂肪沉积也有关系。束刚等指出，性别和部位的不同会影响36对鸡脂肪的调控。张松研究指出，36基因与秦川牛肌内脂肪沉积(IMF)等肉用性状显著相关。本研究以早胜牛为对象，通过检测36基因在不同组织中的mRNA相对表达量，分析肌肉组织与肌内脂肪沉积(IMF)的关系；并利用PCR-SSCP法对早胜牛36基因第9外显子进行多态性检测，分析其与肉用性状的相关性，为早胜牛的肉质选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

于宁县某牧业有限责任公司和宁县某早胜肉牛调运中心选取300头健康的12月龄早胜牛，静脉采血7 mL，加抗凝剂摇匀后-20 ℃保存备用。根据多态性分析结果，选择与基因型对应的1.5岁早胜牛进行屠宰，每种基因型屠宰3头，测定其宰前活重、胴体重、眼肌面积、背膘厚度、肌内脂肪含量等肉用性能指标，并采集腿肌、背最长肌、心脏、肝脏四个部位的组织样品，将组织表面用DEPC水配制的生理盐水冲洗并剪成小块放入无RNA酶的2 mL冻存管，迅速投入液氮中，带回实验室后于-80 ℃保存备用。

1.2 基因组DNA提取、总RNA提取及反转录

基因组DNA用D3392-01型全血DNA提取试剂盒提取，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，使用紫外分光光度计检测DNA的浓度。

按照试剂盒操作说明，提取早胜牛上述不同组织总RNA，用核酸蛋白测定仪检测RNA质量，使用反转录试剂盒获得cDNA，产物-20 ℃保存。

1.3 引物设计与合成

参考NCBI数据库中牛的36基因(GenBank ID：NC_037331、NM_174010.3)和基因(登录号：NM_001034034)，采用Primer 5.0及Oligo 6.0软件设计特异性引物，由北京天一辉远生物科技有限公司和大连TaKaRa公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 PCR扩增

以基因组DNA样品为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：总体积25 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL(10 pmol/μL)、DNA模版1 μL(100 ng/μL)，ddHO 9.5 μL；PCR反应程序见表2。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶检测。

表2 PCR反应程序Table 2 The protocol of PCR reaction

1.5 PCR产物SSCP分型及测序

取PCR扩增产物2.0 μL与上样缓冲液6.0 μL(V(6×buffer)：V(98%甲酰胺)=1:3)混合，98 ℃变性10 min，迅速置于冰上冷却10 min，然后于4 ℃下在100 g/L的聚丙烯酰胺凝胶(V(丙烯酰胺)∶V(亚甲双丙烯酰胺)=29:1)上160 V 电泳15 h，参照徐建峰等的银染法对凝胶进行染色，根据银染后条带的位置和数量判定基因型，将不同基因型产物送至北京天一辉远生物科技有限公司进行纯化与测序。

1.6 qPCR检测

RNA样品进行实时荧光定量PCR反应，扩增体系(20 μL)：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Primer1 (10 μM) 0.4 μL，Primer2 (10 μM)0.4 μL，Template cDNA 1 ul，ddHO加至20 μL。

qPCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃反应10 s，51 ℃反应30 s，40个循环；融解曲线：95 ℃反应60 s，60 ℃反应60 s，95 ℃反应15 s。

1.7 数据统计处理

用DNAStar 8.0软件对DNA测序获得的序列进行分析，使用PopGene 32软件计算基因型频率、纯合度(Ho)、杂合度(He)和多态信息含量(PIC)，采用SPSS 19.0软件分析不同SNPs位点基因型与肉用性能的相关性。

qPCR得到的目的基因36和的Ct值，采用2法计算检测基因的相对表达量,使用SPSS 19.0软件，采用单因素方差分析和相关分析，统计分析mRNA表达量与IMF含量的相关性。

2 结 果

2.1 DNA与RNA质量检测

经分析，DNA的OD/OD在1.8～2.0之间，且纯度较好。用核酸蛋白测定仪结果显示，RNA的OD/OD在1.8～2.0之间，说明提取的RNA质量较好。

2.2 早胜牛CD36基因PCR扩增

以血液基因组DNA为模板，对36基因第9外显子进行PCR扩增。将扩增产物进行SSCP分析。结果显示(图1)，存在2种基因型，分别命名为TT、TC。经测序分析发现36第9外显子在83125 bp处发生T/C突变(图2)。

图1 CD36基因PCR-SSCP分析图Fig.1 PCR-SSCP detection of CD36

图2 CD36基因9外显子PCR产物测序峰图Fig.2 Sequencing peak of exon 9 in CD36 gene

2.3 CD36基因遗传特性分析

本研究表明，T83125C位点，优势等位基因和优势基因型分别为T(0.96)和TT(0.92)。由表3可知，36基因T83125C位点的纯合度大于0.9，且高于杂合度。PIC<0.25，属低度多态。经哈迪-温伯格平衡(χ)检验，并对照卡方临界值，该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(>0.05)。

表3 CD36基因第9外显子突变区域遗传学参数Table 3 Genetic diversity parameters of the mutational region in CD36 gene

2.4 早胜牛CD36基因第9外显子多态性与肉用性能关联分析

将36基因第9外显子多态性与早胜牛的肉用性能进行关联分析，由表4可知，T83125C位点，TC型的宰前活重、胴体重、肌内脂肪都显著高于TT型(<0.05)，而两种基因型的屠宰率、背膘厚度、眼肌面积无显著差异(>0.05)。

表4 早胜牛CD36基因第9外显子不同基因型与肉用性能的关联性分析Table 4 Correlation analysis between different genotypes of CD36 gene exon 9 and meat quality for Zaosheng cattle

2.5 CD36基因不同组织mRNA表达分析

由图3可知，36基因在早胜牛的4个组织中均有表达，以肝脏为对照，表达水平由高到低依次为心脏、腿肌和背最长肌和肝脏，心脏、腿肌和背最长肌中的mRNA表达量间无显著性差异(>0.05)，但心脏的mRNA表达量显著高于肝脏(<0.05)。

图3 CD36基因在早胜牛不同组织中mRNA相对表达量Fig.3 Relative mRNA expression of CD36 gene in different tissues of Zaosheng cattle

2.6 CD36基因在肌肉组织中的mRNA表达量与IMF含量相关分析

由表5可知，早胜牛背最长肌中的36基因mRNA 表达量与IMF含量呈显著相关(<0.05)，相关系数为0.855；腿肌中36基因mRNA 表达量与IMF含量无显著相关(>0.05)，相关系数为0.635。

表5 CD36基因mRNA表达量与IMF含量的相关分析Table 5 Correlation analysis of CD36 gene mRNA expression and IMF content

3 讨 论

3.1 CD36基因多态性分析

CD36作为脂肪酸转运体，在肝脏、肌肉及脂肪组织中介导LCFA的摄取和转运，并介导氧化ox-LDL在单核细胞/巨噬细胞、血小板、内皮细胞的摄取。近年来，对36的研究多集中于人类的疾病上，36基因多态性与体内脂代谢相关，是胰岛素抵抗、代谢综合征、脂代谢紊乱、左心室肥大等疾病的重要风险因素。丁法明等研究发现，动脉硬化心脏病与36基因多态性存在相关性，是导致动脉硬化心脏病发病的遗传因素。以上研究表明这些疾病的发生均与36相关，是由于36调控的脂质代谢发生了紊乱，从而导致了代谢疾病的发生。因而很多学者考虑36基因可能是这些代谢疾病的潜在治疗靶点。李万贵等研究发现，樱桃谷鸭36基因第九外显子中存在1个SNP位点，该位点对优质低脂肪鸭品种的选育具有重要意义；张松研究发现，36基因存在4个多态位点，并且这些位点和肉用性能具有很大的关联性，尤其是对肌内脂肪含量影响显著。本研究发现，36基因第9外显子在83 125 bp处发生T/C突变，具有和2种基因型，其中优势等位基因和优势基因型分别为T(0.96)和TT(0.92)。通过2种基因型与早胜牛肉质性状进行关联分析发现，基因型在宰前活重、胴体重、肌内脂肪都显著高于TT的基因型，说明在早胜牛36基因中，由突变产生的C等位基因是提高早胜牛宰前活重、胴体重、肌内脂肪的优势基因，而基因型的肌内脂肪含量显著高于TT型，说明基因型有可能在早胜牛脂肪酸代谢调控中起关键作用。本次试验只发现了和2种基因型，没有发现基因型，可能与试验样本量有关，下次试验应加大样本量；基因型为优势基因型，但是为杂合子，在实践选育时应辅于后裔测定，综合评价基因型早胜牛的生产性能是否存在稳定性。肌内脂肪是影响牛肉品质的重要指标之一，与肉的嫩度、系水力存在相关性，是影响肉品质风味的主要物质。因此，36基因的多态性对早胜牛的肉品性状存在显著影响，T83125C位点可作为早胜牛肉用性状分子标记位点，36基因可作为早胜牛肌内脂肪沉积和肉质性状的候选基因。

3.2 CD36基因组织表达规律

CD36作为一种膜蛋白，对细胞LCFAs的摄取有重要的作用，可以介导多种细胞类型(如单核细胞、微血管内皮细胞、血小板、脂肪细胞、巨噬细胞、肌肉细胞、肠上皮细胞和肝细胞)从细胞内长链脂肪酸的循环和转运中摄取游离脂肪酸(FFA)。研究发现，缺乏36的小鼠其骨骼肌和脂肪组织对脂肪酸的摄取和利用存在缺陷。36介导的脂肪酸过量摄取在脂肪肝变性中起重要作用。36在正常肝组织中表达量很低，但在高脂饮食(HFD)诱导的脂肪肝小鼠和人非酒精性脂肪肝(NAFLD)的肝组织中表达量显著升高。陈欣等研究指出，脂肪和胆固醇含量高的饲料能够引起贵州小型猪的脂质代谢紊乱，并且可使肝组织、胸主动脉和肾脏组织的36表达上调。36在存储中性脂质的脂肪组织以及以脂肪酸为能量生产底物的心脏和骨骼肌中高度表达，而在肝脏中不表达或表达极低。廖红海报道，36基因在山羊心脏中mRNA的表达量最低，背最长肌次之、肝脏较高；王单单对樱桃谷鸭研究表明，36基因mRNA在脂代谢旺盛的组织皮脂、腹脂或肝脏中表达量较高,mRNA表达均对血清脂质指标有显著效应,说明36基因可能调控肉鸭脂质的沉积。以上研究显示36基因在机体内的表达会随着脂肪水平的变化而不同，在脂肪含量高的组织其表达量会相对较高，说明其可能对机体的脂肪代谢起调节作用。有研究指出，剧烈运动时肌肉的收缩会引起36、FABP 和FATP 从内体快速转移到质膜上，促进脂肪酸的大量摄入以供能量代谢的需要，提高CD36的表达水平。Astorino等研究显示，对机体进行高强度间歇训练或增加训练量会提高36的蛋白表达水平。Rocha-Rodrigues等研究显示耐力训练可以增加高脂饮食大鼠的36、线粒体复合物IV和V亚基的含量。由此可知，运动、锻炼、电刺激等因素可以促进机体脂肪酸的代谢，从而提高36的表达量。本研究结果显示，36基因在早胜牛的4个组织中均有表达，表达水平由高到低依次为心脏、腿肌、背最长肌和肝脏，心脏、腿肌和背最长肌中的mRNA表达量无显著性差异(>0.05)，但心脏的mRNA表达量显著高于肝脏(<0.05)，这与上述文献所呈现规律基本一致。心脏、腿肌mRNA表达量高于背最长肌可能是由于在日常生活中，早胜牛腿部活动较多，使心脏和腿部肌肉受到刺激较大，从而使得脂肪酸大量摄入以供能量代谢需要，提高了36的表达量。通过相关性分析发现早胜牛背最长肌中的36基因mRNA 表达量与IMF含量呈显著相关(<0.05)，相关系数为0.855，说明36基因可能参与早胜牛的脂肪代谢，在不同组织部位其表达量存在差异，可作为肌内脂肪沉积的候选基因。

4 结 论

早胜牛36基因第9外显子g.83125处发生T/C突变，表现为和2种基因型，该位点与早胜牛的宰前活重、胴体重、肌内脂肪含量显著相关。36基因在不同组织中均有表达，表达水平由高到低依次为心脏、腿肌、背最长肌和肝脏，背最长肌中的36基因mRNA 表达量与IMF含量呈显著正相关(<0.05)。认为36基因T83125C位点可作为早胜牛肉用性能分子标记位点，36基因可作为早胜牛肌内脂肪沉积和肉用性能的候选基因。