基于网络药理学和分子对接技术探讨中药复方防治新型冠状病毒肺炎的作用机制

潘大波，姜德文，李小飘，王小霞

基于网络药理学和分子对接技术探讨中药复方防治新型冠状病毒肺炎的作用机制

潘大波，姜德文，李小飘，王小霞

黔东南民族职业技术学院，贵州 凯里 556000

运用网络药理学和分子对接技术探讨中药复方防治新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的作用机制。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）及SwissTargetPrediction数据库获取中药复方的活性成分及靶点，在GenCLiP 3和GeneCards数据库筛选新型冠状病毒肺炎疾病靶点，与中药复方活性成分靶点取交集，构建中药-活性成分-靶点网络。通过STRING数据库及Cytoscape3.7.1软件构建蛋白相互作用（PPI）网络，通过DAVID进行GO功能与KEGG通路富集分析。采用AutoDock Vina对中药活性成分及COVID-19疾病靶点进行分子对接初步验证。从中药复方中筛选出163个活性成分，作用于952个靶点，其中与COVID-19相关靶点264个，获得9味药、150个活性成分和264个靶点的中药-活性成分-靶点网络。度值＞15.05的关键作用靶点共72个，富集分析得到生物过程、细胞组成和分子功能共108个及20条相关通路。PPI网络显示AKT1、EGFR、HSP90AA1、PTGS2、MTOR、MAPK14、ERBB2、PIK3CA、EP300和PIK3R1起关键作用。分子对接显示，中药复方活性成分与3CL水解酶、ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白对接打分和关键靶点的结合亲和力较好。中药复方的活性成分能作用于AKT1、EGFR、HSP90AA1、PTGS2、MTOR、3CL水解酶和ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白等靶点，调节多条信号通路，发挥抗炎和免疫调节等作用，进而起到对COVID-19的防治作用。

中药复方；新型冠状病毒肺炎；网络药理学；分子对接

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）严重威胁着人类健康，其进展以细胞因子释放失调、肺炎和急性肺损伤为特征，与血液学和免疫学反应有关[1-2]，中医药可以针对这2个方面发挥作用[3]，中医药的多成分-多靶点作用机制，对于治疗复杂性疾病具有较好的优势。

我国《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》自第六版起推荐使用中医药预防和治疗COVID-19。贵州省中医药管理局2020年1月公布了彭玉教授防治儿童COVID-19的中药复方[4]：板蓝根20 g，贯众15 g，广藿香10 g，薄荷10 g，菊花15 g，荆芥10 g，葛根6 g，芦根10 g，甘草6 g。其中芳香类中药广藿香、薄荷、荆芥广泛用于治疗COVID-19的药方中。本研究结合网络药理学、分子对接等技术，从中药多成分、多靶点的角度出发，探讨该复方的活性成分及防治COVID-19的作用机制，为今后的研究提供参考。

1 方法

1.1 中药复方活性成分筛选及靶点预测

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com）检索板蓝根、贯众、广藿香、薄荷、菊花、荆芥、葛根、芦根、甘草的活性成分，以类药性（DL）≥0.18和口服生物利用度（OB）≥30%为条件筛选主要活性成分[5]。将活性成分转成SMILES格式，导入SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测[6]，选取Probability值＞0的靶点作为活性成分的作用靶点。

1.2 新型冠状病毒肺炎疾病靶点筛选

通过GenCLiP3（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）[7]和GeneCards（https://www.genecards.org）数据库[8]，以“COVID-19”“SARS-CoV-2”和“novel coronavirus pneumonia”为关键词，检索COVID-19相关基因和蛋白靶点信息，去除重复靶点，运用UniProt（https://www.uniprot.org/）[9]校正整合，收集与COVID-19相关的作用靶点作为疾病靶点。将COVID-19疾病靶点与中药复方活性成分作用靶点进行叠合，获得中药复方活性成分治疗COVID-19的交集靶点。

1.3 中药-活性成分-靶点网络构建

使用Cytoscape3.7.1软件[10]构建中药-活性成分-靶点网络。运用插件Centiscape 2.2计算网络的度（Degree）值、中介值等，提取度值大于中介值的靶点作为中药复方治疗COVID-19疾病的关键靶点。采用插件yFiles Layout Algorithms进行可视化排布显示。

1.4 交集基因蛋白相互作用网络构建

将“1.3”得到的中药复方治疗COVID-19疾病的关键靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/）[11]，限定物种为人，获取交集基因的蛋白相互作用（PPI）网络。将结果导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化和网络分析。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析

将交集靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）[12]进行GO功能和KEGG通路富集分析。每个项目以富集大于5个靶点且＜0.05为条件进行筛选。

1.6 分子对接

选取SARS-CoV-2生命周期过程中起关键作用的蛋白3CL水解酶（PDB ID：6LU7）[13]、ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白（PDB ID：6M17）[14]和“1.3”构建的中药-活性成分-靶点网络中度值排名前5的关键靶点进行分子对接。配体选用“1.1”收集的中药复方活性成分，采用AutoDock Vina软件进行对接。

2 结果

2.1 中药复方活性成分及作用靶点

从TCMSP检索板蓝根、贯众、广藿香、薄荷、菊花、荆芥、葛根、芦根和甘草满足DL≥0.18和OB≥30%的活性成分，分别为39、7、11、10、20、11、4、1和92个，去重后得到163个活性成分。

运用SwissTargetPrediction对163个活性成分进行靶点预测，得到952个靶点。即163个活性成分作用于952个靶点。

2.2 新型冠状病毒肺炎疾病靶点

运用关键词“COVID-19”“novel coronavirus pneumonia”和“SARS-CoV-2”在GenCLiP 3检索得到156个靶点，GeneCards得到2 546个靶点，运用UniProt校正，合并去重后得到2 577个靶点。与163个中药复方活性成分作用的952个靶点有264个交集靶点。将264个靶点映射到活性成分中得到150个活性成分，即150个活性成分作用于264个靶点发挥治疗COVID-19的作用。

2.3 中药-活性成分-靶点网络

将中药复方药味、活性成分及对应COVID-19疾病靶点导入Cytoscape 3.7.1获得中药-活性成分-靶点网络，有423个节点（9味药、150个化合物和264个靶点）、3 184条边（边代表节点与节点之间相互作用的个数）。将度值大于中介值（15.05）的节点（化合物和靶点）提取出来，获得关键的中药-活性成分-靶点网络（见图1）。

注：浅灰色菱形代表活性成分，椭圆形为疾病靶点

从图1可以看出，度值＞15.05的疾病靶点共72个，其中度值≥36的疾病靶点有19个（见 表1），排名前5的是ACHE、CA12、EGFR、GSK3B和AR。

图1中，度值＞15.05的活性成分有89个，其中度值≥36的有17个（见表2），分别来源于6味中药（甘草、板蓝根、荆芥、薄荷、菊花、广藿香），作用较强的化合物有MOL004820、MOL004879、MOL001803、MOL005012、MOL001735、MOL004978和MOL011856等。

表1 中药复方治疗COVID-19中药-活性成分-靶点网络度值≥36的靶点

表2 中药复方治疗COVID-19中药-活性成分-靶点网络度值≥36的活性成分

2.4 关键靶点蛋白相互作用网络

72个关键靶点导入STRING绘制PPI网络（见图2），度值＞16的靶点有24个，其中排名前10的靶点有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）1、表皮生长因子受体（EGFR）、热休克蛋白90AA1（HSP90AA1）、环加氧酶-2（PTGS2）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、MAPK14、酪氨酸激酶受体2（ERBB2）、PIK3CA、EP300和PIK3R1。

2.5 GO功能富集分析

将72个靶点运用DAVID进行GO功能富集分析，选取富集5个以上靶点且＜0.05的生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），分别得到60、21和27条项目，其中BP、CC和MF排名前10项见图3。BP主要集中在调控信号转导（signal transduction）、蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、磷脂酰肌醇介导的信号传导（phosphatidylinositol-mediated signaling）和凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）等。CC主要集中在胞质溶胶（cytosol）、细胞质（cytoplasm）、核（nucleus）、质膜（plasma membrane）和膜（membrane）等。MF主要集中在蛋白质结合（protein binding）、ATP结合（ATP binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、激酶活性（kinase activity）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。

图2 中药复方治疗COVID-19关键靶点PPI网络

2.6 KEGG通路富集分析

72个关键靶点富集5个以上靶点且＜0.05的KEGG通路有20条（见图4），主要调控PI3K-Akt signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、T细胞受体（T cell receptor ）signaling pathway、mTOR signaling pathway和Rap1 signaling pathway等。

2.7 分子对接分析

选取SARS-CoV-2的3CL水解酶（PDB ID：6LU7）、ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白（PDB ID：6M17）和中药-活性成分-靶点网络中度值排名前5位的关键靶点ACHE（PDB ID：6O5V）、AR（PDB ID：2Q7K）、GSK3B（PDB ID：2X39）、EGFR（PDB ID：5HG8）和CA12（PDB ID：5LL5）进行分子对接，3CL水解酶、ACHE、AR、GSK3B、EGFR和CA12活性位点根据配体定义，ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白活性位点根据GLY502、TYR505、TYR489、LYS417、ASN487、ASN501定义[15]。与3CL水解酶、ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白、ACHE、AR、GSK3B、EGFR和CA12结合亲和力高于7.5 kcal/mol的活性成分分别有78、72、155、47、147、134及75个。中药活性成分与ACHE、AR、GSK3B、EGFR和CA12靶点的亲和力均较强。这与中药-活性成分-靶点网络的结果是一致的。

图3 中药复方治疗COVID-19靶点GO功能富集分析

图4 中药复方治疗COVID-19靶点KEGG通路富集分析

为了进一步探究活性成分与靶点之间的相互作用模式，针对3CL水解酶和ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白体系，分别选取打分最好的3个小分子进行相互作用分析（见图5、图6）。从图5可以看出，MOL001790（Linarin）与3CL水解酶的Thr26、His41、Try54、Ser144、His163和Thr190形成7个氢键，且Linarin很好地嵌入3CL水解酶的活性口袋中。与Linarin相比，MOL001810（6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one）和MOL005018（Xambioona）与3CL水解酶的氢键相互作用减少，但是刚性更强，更好地嵌入3CL水解酶的活性口袋。

从图6可以看出，ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白与Linarin、MOL004860（Licorice glycoside E，甘草苷E）和MOL011616（Fortunellin）之间主要是氢键相互作用，分别形成了12、13及14个氢键。

注：青色为3CL水解酶二级结构，黄色为活性成分，绿色为氨基酸

注：粉色为ACE2，青色为SARS-CoV-2 S蛋白，黄色为活性成分，绿色为氨基酸

3 讨论

COVID-19是由SARS-CoV-2感染引起的复杂疾病。抑制SARS-CoV-2的生命周期、缓解SARS-CoV-2感染引起的免疫反应，如免疫血栓、细胞因子风暴、炎症等是中医药防治COVID-19的切入点。

3.1 中药复方活性成分的防治分析

本研究构建了由9味药、150个活性成分和264个靶点组成的中药-活性成分-靶点网络，提取得到度值≥36的17个活性成分作为防治COVID-19的核心成分，来源于甘草、板蓝根、薄荷、菊花、荆芥和广藿香6味中药，这些核心成分主要是黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、免疫调节等药理活性[16-18]。甘草中的MOL004820（Kanzonols W，康唑醇W）、MOL004806（Euchrenone，山豆根酮）能够抑制Nrf2（核转录因子E2相关因子2）和NF-кB（核因子кB）[19]。板蓝根中的MOL001803（Sinensetin，橙黄酮）能够抑制环氧合酶-2（COX2）、iNOS（诱导型一氧化氮合酶）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达，抑制STAT3（信号转导和转录激活因子3）和NF-κB通路，调控白细胞介素6（IL-6）等[20]。广藿香、菊花、荆芥和甘草中的MOL000098（Quercetin，槲皮素）显示很强的抗SARS-Cov-2活性[21]。板蓝根和菊花中的MOL001733（Eupatorin，半齿泽兰素）具有抗炎作用[22]。薄荷、菊花和荆芥中的MOL000006（Luteolin，木犀草素）通过抑制脂多糖（LPS）刺激的TNF-α和IL-6的释放，调控Toll样受体（TLR）信号通路和凋亡因子的表达，通过免疫调节发挥抗病毒作用[23]。

分子对接显示，来源于板蓝根、薄荷和菊花的Linarin、板蓝根的6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one和甘草的Xambioona与3CL水解酶结合较强，Linarin、Licorice glycoside E（甘草苷E，来源于甘草）和Fortunellin（来源于薄荷）能够较好地嵌入ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白的活性口袋中。

3.2 核心靶点与COVID-19的关联分析

PPI网络显示，度值排名靠前的靶点有AKT1、EGFR、HSP90AA1、PTGS2、MTOR、MAPK14、ERBB2、PIK3CA、EP300和PIK3R1。这些核心靶点与SARS-Cov-2感染导致的免疫血栓、炎症等有关，最终导致COVID-19。

SARS-CoV-2感染导致的COVID-19会导致患者免疫系统产生过度激活，活化的中性粒细胞和单核细胞与血小板和凝血级联反应相互作用，导致血管中形成血管内凝块，即免疫血栓[2]。AKT1、EGFR及调控血管生成的重要酶是防治COVID-19的重要靶点[24]。MAPK激活能诱导产生和释放促炎细胞因子，从而阻断炎症[25]。SARS-CoV-2结合ACE2导致肾素-血管紧张素-醛固酮系统失衡，过量血管紧张素Ⅱ通过AKT1受体调控内皮细胞激活、IL-6和ROS产生，最后激活PI3K-Akt信号通路[26]。此外，IL-6与免疫细胞的mIL-6R结合，形成IL-6/IL-6R/gp130复合物，以激活下游JAK/STAT3、Akt/mTOR和MAPK信号传导[27]。PTGS2在炎症发生过程中起着重要的作用[20]。HSP90被认为是保护不同压力的保护因子，针对SARS-CoV-2感染具有保护作用[28]。

3.3 关键靶点富集通路与COVID-19的关联分析

KEGG通路富集分析显示，中药复方活性成分的关键靶点主要集中在炎症和免疫调节等通路方面。与COVID-19产生炎症相关的通路有TNF signaling pathway、趋化因子（Chemokine）signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway和TRP通道的炎症介质调节（Inflammatory mediator regulation of TRP channels）等[27]。与内皮细胞活化和功能障碍相关的通路有VEGF signaling pathway[26]。与免疫调节相关的有T cell receptor signaling pathway、B cell receptor signaling pathway、TLR signaling pathway、自然杀伤细胞介导的细胞毒性（Natural killer cell mediated cytotoxicity）等[2]。即中药复方通过多通路、多途径发挥防治COVID-19的作用。

4 结语

运用网络药理学技术，从中药复方中获得潜在活性成分及其作用靶点、通路，进一步运用分子对接技术考察活性化合物与关键靶点之间的亲和力。彭玉教授提供的防治儿童COVID-19的中药复方主要通过作用于ACHE、CA12、EGFR、ACE2-SARS-CoV-2 S蛋白和3CL水解酶等靶点，调控PI3K-Akt、HIF-1和Rap1等多条抗炎和免疫调节信号通路，防治COVID-19。

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Discussion on Mechanism of TCM Compounds for Prevention and Treatment of COVID-19 Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

PAN Da-bo, JIANG De-wen, LI Xiao-piao, WANG Xiao-xia

(Qiandongnan National Polytechnic, Kaili 556000, China)

To discuss the mechanism of TCM compounds for prevention and treatment of COVID-19 using network pharmacology and molecular docking.The active components and targets of TCM compounds were extracted from TCMSP and SwissTargetPrediction. The COVID-19-related disease targets were obtained from GenCLiP 3 and GeneCards database. The intersection targets were obtained with the active component targets of TCM compounds, and the TCM-active components-target network was constructed. The protein - protein interaction (PPI) network was constructed by STRING database and Cytoscape 3.7.1 software, and GO function and KEGG pathway enrichment analysis was conducted using DAVID. AutoDock Vina was used to conduct preliminary verification of molecular docking of active components of TCM and COVID-19 disease targets.Totally 163 active components of TCM compounds were obtained, interacted with 952 targets, of which 264 targets were related to COVID-19. The TCM-active component-target network of nine types of Chinese materia medica, 150 active components and 264 targets were obtained. There were a total of 72 key targets with a degree value greater than 15.05. GO enrichment analysis showed that there were 108 biological processes, cellular components and molecular functions, which were enriched in 20 COVID-19 related pathways. AKT1, EGFR, HSP90AA1, PTGS2, MTOR, MAPK14, ERBB2, PIK3CA, EP300 and PIK3R1 played an important role in target-target interaction network. Molecular docking illustrated that the active components of the TCM compounds had good binding affinity with 3CL hydrolase, ACE2-SARS-CoV-2 S protein and key targets.The active components of TCM compounds can act on targets such as AKT1, EGFR, HSP90AA1, PTGS2, MTOR, 3CL hydrolase and ACE2-SARS-CoV-2S protein to regulate multiple signaling pathways to play anti-inflammatory and immunomodulatory effects, thereby preventing and treating COVID-19.

TCM compounds; COVID-19; network pharmacology; molecular docking

潘大波,姜德文,李小飘,等.基于网络药理学和分子对接技术探讨中药复方防治新型冠状病毒肺炎的作用机制[J].中国中医药图书情报杂志,2022,46(4):9-16.

R259.631；R285

A

2095-5707(2022)04-0009-08

10.3969/j.issn.2095-5707.2022.04.002

贵州省科技支撑项目（黔科合支撑[2020]4Y087号）；黔东南民族职业技术学院院级课题（20zyyjzd01）

潘大波，E-mail: pandabo05@163.com

（2021-08-24）

（2022-01-05；编辑：魏民）