CD19和CD22双靶点CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

李薇，曾伟杰，彭浩，刘灿，刘广花，肖非笛，曾桂芳，梁晓，蔡车国，胡隽源，周明[.湖南省人民医院（湖南师范大学附属第一医院）血液内科，湖南 长沙 40005；.深圳市北科生物科技有限公司，广东 深圳58057]

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法相比于传统的肿瘤治疗方法（如放疗、化疗等），其对血液瘤的疗效是使人振奋的，尤其是用于复发、难治性B细胞淋巴瘤患者的针对CD19靶点的CAR-T细胞治疗具有很好的疗效[1-5]。但这一单靶向的细胞也并不能保证一劳永逸，对于B 细胞非霍奇金淋巴瘤（B-cell non-Hodgkin's lymphoma，B-NHL），其回输后无治疗效果的患者占30%～40%，即大多数患者并不能得到理想的疗效[2,6-7]。B细胞肿瘤复发的常见因素是肿瘤细胞表面抗原CD19的下调和CD19阴性细胞的增加[8-11]。B-NHL在使用抗CD19 CAR-T细胞治疗后约30%的患者表现为CD19阴性，这表明单一靶向治疗对CD19抗原的影响[12-13]。那么，同时靶向多个B细胞抗原成为一种可能更优的治疗策略，以降低抗原免疫逃逸介导的复发风险[14-16]。已有临床研究结果表明，针对表面抗原CD22的CAR-T细胞具有良好的临床疗效[17]，针对CD19和CD22设计双靶向的CAR则十分具有吸引力。如今常见的CAR结构大多采用CD3复合物中的CD3ζ链为T细胞激活结构域，作为CD3复合物不同亚基的CD3ε链，若将部分CD3ε链整合到第二代CAR的共刺激结构中，可以提高相应CAR-T细胞的抗肿瘤效果，同时CD3ε链相关的C末端Src激酶招募基于免疫受体酪氨酸的激活基序以减少CAR-T细胞因子的分泌水平，而CD3ε的富碱性残基序列，通过招募p85减少CAR-T细胞的耗竭[18]。为降低治疗过程中的免疫逃逸和产生细胞因子风暴的风险，增强对两个靶点的特异性杀伤能力，本研究设计了一种包含两个独立CAR分子的双靶点CAR-19-22-T结构，其中一个CAR分子的穿膜结构域和信号转导结构域直接用部分的CD3ε 链替换，然后获得足量相应的CAR-T细胞，验证其体内外对肿瘤细胞的杀伤能力。

1 材料与方法

1.1 细胞、实验动物及主要试剂

慢病毒制备用细胞HEK-293T、B-NHL细胞和人前列腺癌3M细胞均购自美国ATCC细胞库，人Burkitt′s淋巴瘤细胞Raji-Luc由深圳市北科生物科技有限公司提供，人外周血单个核细胞（PBMC）从健康志愿者捐献的外周血中经Ficoll密度梯度离心获得。

SPF 级6 周龄、体质量为（20±3）g 的雌性NODSCID免疫缺陷小鼠购自珠海百试通生物科技有限公司，实验动物许可证号：SCXK（粤）2020-0051。

贴壁细胞所用DMEM高糖培养基和悬浮细胞所用RPMI 1640培养基购自美国Gibco 公司，培养基添加物胎牛血清（FBS）购自美国HyClone 公司，T 细胞培养基X-Vivo15 购自美国Lonza公司，相关质粒由广州艾基生物科技有限公司合成，D-Luciferin 和ATP 试剂购自中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司，IFN-γ、TNF-α 和IL-2 ELISA试剂盒购自美国R&D 公司，FITC 标记人CD19和CD22 蛋白购自北京百普赛斯公司，APC抗人CD19和CD22抗体购自美国Bioleagend公司，Transact激活磁珠购自德国美天旎公司。

1.2 细胞培养

HEK-293T 和3M 细胞为贴壁细胞，以含有10%PBS的DMEM高糖培养基培养；Raji-Luc细胞为悬浮细胞，以含有10% PBS 的RPMI 1640 培养基培养；供者的PBMC 和肿瘤细胞分开培养，使用含有10%自体血浆的X-Vivo15 培养基，所有细胞的培养箱培养参数均为37 ℃、5%CO2。

1.3 质粒构建

由上海生工生物工程有限公司合成CD19、CD22和荧光素酶（luciferase）表达片段，分别将CAR-19、CAR-22 和CAR-19-22 目的片段，序列直接连接入慢病毒载体pLTR-CMV-MCS中，经测序检验验证。

1.4 慢病毒包装与滴度检测

将慢病毒载体质粒与包装质粒pCMV-VSVG 和pCMV-ΔR 8.91共转染HEK-293 T细胞，转染后24 h更换新的含FBS高糖DMEM培养基，48 h后收取培养上清即病毒原液，后加入新的含FBS高糖DMEM培养基，72 h后最后一次收取病毒原液。病毒原液加入1/3体积的40%PEG6000 溶液，24 h 后在4 ℃、2 000×g离心45 min后，将沉淀以病毒原液的1/100体积溶解在X-Vivo15培养基中，取2.5 μL进行病毒滴度检测。

1.5 CAR-T细胞的制备、培养和阳性率检测

用Ficoll密度梯度离心法从健康志愿者外周血中分离出PBMC，经X-Vivo15培养基重悬后，添加10%培养体积的血浆、终活性浓度为300 U/mL的IL-2。加入1/100培养体积的美天旎TransAct 磁珠液激活T细胞，3 d后内加入慢病毒（MOI=20），32 ℃下300×g离心60 min，进行离心感染。感染后第2天经离心去除有慢病毒的培养基，加入含10%自体血浆和300 U/mL IL-2的新培养基继续培养，间隔1 d进行细胞计数后补液，使细胞密度维持在（1～5）×106/mL水平。加入慢病毒感染48 h后，每次换液时均取少量细胞进行阳性率检测。使用FITC标记人CD19和CD22蛋白，通过FCM检测CAR阳性率。

1.6 构建3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc和3M-CD19-CD22-Luc靶细胞

分别使用pLTR-CMV-CD19-Luc、pLTR-CMVCD20-Luc与辅助质粒一起包装CD19和CD20慢病毒。以CD19 和CD22 阴性的3M 细胞为基础，将CD19 和CD20慢病毒分别转染3M细胞，分别进行流式分选，得到表达荧光素酶的3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc及3M-CD19-CD22-Luc细胞，作为CAR-T细胞的靶细胞。使用APC抗人CD19和CD22抗体分别检测靶细胞CD19和/或CD22表达率。

1.7 荧光素酶化学发光法检测CAR-T 细胞对靶细胞的杀伤效率

靶细胞铺于96 孔平底板，每孔7×103个靶细胞（悬液100µL），在细胞培养箱中继续培养18 h。同一天取足量CAR-T细胞及对照T细胞分别转移到15 mL离心管，以500×g离心5 min、弃上清，用不添加IL-2只添加自体血浆的X-Vivo15 培养基重悬细胞后，处理18 h。次日，以相同参数离心细胞，弃上清，加入只添加自体血浆的X-Vivo15 培养基混匀后计数，同时进行靶细胞计数，然后以2.5∶1、5∶1、10∶1 梯度的效靶比，在96 孔板中加效应细胞并补加T 细胞培养基至100 μL；每个效靶比设置6 个复孔。共培养24 h后，取出96 孔细胞培养板，每孔加入50 μL 2%Triton裂解液，反复吹匀，静置3～5 min，取50 μL裂解液置于黑色96孔板中，加入50 μL底物（300 μg/mLD-Luciferin水溶液与2 mg/mL ATP 水溶液按照体积比为3∶1 混和）吹吸混匀。30 min 后用酶标仪检测其化学发光值。以不加效应细胞作为杀伤靶细胞实验的空白对照，以T 细胞对相应靶细胞的杀伤作用作为阴性对照，杀伤效率=[（空白对照荧光平均值-实验组荧光平均值）/空白对照荧光平均值]×100%。相同效靶比的CAR-T 细胞杀伤效率减去T 细胞杀伤效率，即为CAR-T细胞的实际杀伤率。

1.8 ELISA法检测CAR-T细胞杀伤靶细胞时上清中IFN-γ、TNF-α和IL-2水平

收集体外杀伤实验的培养上清液，采用ELISA试剂盒检测CAR-T细胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2因子的水平，严格按照说明书方法进行操作。

1.9 小鼠Raji-Luc细胞移植瘤模型的建立及CAR-T细胞体内杀伤实验

利用NOD-SCID免疫缺陷小鼠建立急性淋巴细胞白血病模型。将36只NOD-SCID小鼠，以随机表法随机分为4组，每组各9只并加上耳标。第0天（D0）尾静脉注射Raji-Luc细胞4×106/只，1周后（D7）气体麻醉并注射20 mg/mL的D-Luciferin进行活体成像，观测小鼠体内肿瘤细胞负荷情况；同天（D7）从4组小鼠尾静脉分别注射2×106个CAR-19-T、CAR-22-T、CAR-19-22-T细胞及对照T细胞各100 μL。分别在D7、D10、D14、D17、D21、D28、D35、D42、D49使用IVIS Lumina小动物活体成像系统进行成像，观察表达荧光素酶的Raji-Luc细胞在小鼠体内的负荷以及分布情况，借以判断所用的4组细胞对于白血病治疗效果的差别。

1.10 统计学处理

荧光素化学发光实验和ELISA 等实验均重复3次。实验数据均采用GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，符合正态分布的数据以表示，两组间比较选用t检验方法，多组间比较选用单因素方差分析方法，以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功制备CD19和CD22双靶点CAR-T细胞

构建靶向CD19和CD22的双特异性CAR，前半部分为经典第二代CAR分子结构，为CD8先导区、CD19 ScFv、CD8铰链区和穿膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区依次串联，后半部分为CD22 ScFv和CD3ε，中间以P2A相连（图1A）。同时分别设计针对CD19和CD22的单靶点二代CAR结构（图1B）。

FCM检测结果（图2）显示，感染T 细胞3 d后，其中CAR-19-T细胞表达率为29.7%、CAR-22-T 细胞表达率为31.1%，CAR-19-22-T 细胞中CAR-19 和CAR-22表达率分别为19.3%和17.3%（图2A）；感染第7天时，细胞扩增约6～20倍，CAR-19-T细胞表达率为22.7%、CAR-22-T细胞表达率为23.6%，CAR-19-22-T细胞中CAR-19和CAR-22表达率分别为13.7%和14.3%（图2B）。

2.2 成功构建表达CD19、CD22的靶细胞

FCM 检测结果（图3）显示，3M-CD19-Luc 细胞CD19表达率为95.6%，3M-CD22-Luc细胞CD22表达率为95.7%，3M-CD19-CD22-Luc 细胞的CD19 和CD22表达率分别为97.7%和98.8%。

2.3 双靶点CAR-T 细胞特异性杀伤CD19 和/或CD22阳性肿瘤细胞

荧光素酶化学发光法检测结果（图4）显示，3 例捐赠者（#1、#2、#3）的PBMC 所制备的针对CD19 和/或CD22 CAR-T 细胞在2.5∶1、5∶1 和10∶1 效靶比中均能有效杀伤3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc 和3M-CD19-CD22-Luc细胞，杀伤效果随效靶比的增加而增加，其中，CAR-19-22-T细胞在效靶比为10∶1时对3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc和3M-CD19-CD22-Luc细胞的杀伤率均显著高于T 细胞组[（78.1±14.4）%vs（11.1±4.3）%、（46.7±10.7）%vs（12.4±2.7）%、（90.5±4.3）%vs（14.3±3.7）%，均P<0.01]。结果表明，CAR-19-22-T细胞能有效杀伤表达CD19和/或CD22的肿瘤细胞。

2.4 双靶点CAR-T细胞分泌低水平的IFN-γ、TNF-α和IL-2

3 例外周血捐赠者的PBMC 所制备的针对CD19 和/或CD22 CAR-T 细胞与3M-CD19-CD22 靶细胞共培养后，ELISA 法检测结果（图5）显示，CD19 和CD22 双靶点CAR-T 细胞可分泌一定量的IFN-γ、TNF-α 和IL-2，它们作用于3M-CD19、3M-CD22、3M-CD19-CD22靶细胞发挥杀伤作用。

在杀伤3M-CD19-Luc 靶细胞中，CAR-19-22-T细胞组细胞的IFN-γ、TNF-α 和IL-2分泌量均显著低于单靶细胞组细胞（P<0.05 或P<0.01）；在杀伤3M-CD22-Luc 靶细胞中，CAR-19-22-T 细胞组细胞的IFN-γ、TNF-α 和IL-2 分泌量均显著低于单靶细胞组（均P<0.01）；在杀伤3M-CD19-CD22-Luc靶细胞中，CAR-19-22-T 细胞组细胞的IFN-γ、TNF-α 和IL-2 分泌量均显著低于CAR-19-T 组和CAR-22-T 组量（均P<0.01）。结果表明，本研究设计的双靶点CAR-T 细胞和传统的单靶点CAR-T 细胞相比，能分泌相对较少的炎症因子，仍可发挥杀伤作用，但提高了临床应用的安全性。

2.5 双靶点CAR-T 细胞延长NOD-SCID 急性淋巴细胞白血病模型小鼠的生存期

NOD-SCID 小鼠注射稳定表达荧光素酶的Raji-Luc 细胞进行白血病造模成功后，实验结果（图6）显示，在注射CAR-19-T、CAR-22-T和CAR-19-22-T细胞治疗的3组小鼠中，CAR-19-T组和CAR-22-T组较注射T 细胞组具有一定的抑制肿瘤细胞体内生长的作用，CAR-19-22-T 细胞组能有效抑制肿瘤细胞的体内生长，小动物成像系统中肿瘤细胞荧光值较低。同时CAR-19-22-T 细胞治疗组荷瘤小鼠生存期显著长于T 细胞组[（47.2±11.4）vs（27.2±3.7）d，P<0.01]，与CAR-19-T 组、CAR-22-T 组荷瘤小鼠比较差异无统计学意义[（47.2±11.4）vs（34.8±11.9）、（37.8±13.6）d，均P>0.05；图7]。实验结果表明，对比T细胞组，双靶点CAR-T细胞能够有效延长NOD-SCID急性淋巴细胞白血病模型小鼠的生存期。

3 讨论

近年来，针对CD19靶标的CAR-T细胞疗法在治疗B 淋巴细胞肿瘤的临床试验中取得了令人瞩目的成就，但大部分患者仍会出现因CD19缺失而复发[15]。一些研究结果[16,19]表明，同时靶向两种或多种抗原能降低因单一靶点丢失而导致复发的可能性，因此非单一靶点的CAR-T 细胞具有很大的研究意义。而CD22 则是非常有潜力的新靶标之一，因为CD22 仅在B细胞谱系中表达，并且在绝大多数B细胞恶性肿瘤中高表达，在临床试验中也已研究多种CD22定向疗法[20-24]。因此，本研究探索性地设计了一种双靶CAR 结构，可以分别靶向CD19 和CD22 两个不同表面抗原，针对CD19 的部分为一个二代结构，针对CD22的部分在抗原结合结构域后以部分CD3ε链取代二代共刺激结构作为穿膜结构域和信号转导结构域。

本研究验证了CD19、CD22 双靶点CAR-T 细胞，即CAR-19-22-T 细胞能够在体外显著地杀伤CD19 阳性的3M-CD19-Luc 细胞、CD22 阳性的3M-CD22-Luc 细胞，以及CD19 和CD20 双阳性的3M-CD19-CD22-Luc 细胞；与单靶点CAR-T 细胞相比较，双靶点CAR-T 细胞具有更为显著的杀伤肿瘤细胞的能力。由于CD3ε 的存在，本研究的双靶点CAR-T 细胞可显著降低炎症因子如TNF-α、IFN-γ 和IL-2 的分泌水平。临床发生严重细胞因子风暴的原因，往往是伴随血液中TNF-α、IFN-γ和IL-2等因子水平的升高，虽然其他与细胞因子风暴相关的因子，如IL-1、IL-6、IL-10和GM-CSF等在本文并未展现，但相信本研究的CAR-19-22-T 细胞具有提高临床治疗安全性的潜能。在表达荧光素酶的Raji-Luc B 系淋巴瘤细胞小鼠白血病模型中，通过尾静脉回输CAR-19-22-T 细胞，能够有效地抑制小鼠体内Raji-Luc细胞的增殖，较普通T细胞能显著延长荷瘤小鼠的生存期，证明该双靶点CAR-T 细胞体内有效的抗肿瘤能力。

本研究中的双靶点CAR-T细胞对比传统二代单靶点CAR-T 细胞，虽然具有良好的体内外肿瘤杀伤能力及分泌低水平的炎症因子能力，且具备相对更低的脱靶风险。但由于肿瘤细胞异质性的存在，肿瘤细胞不能被完全清除，本研究的CAR-19-22-T细胞也不能避免一般CAR-T细胞的缺陷。且由于双靶点的引入，增加了慢病毒核心载体片段的长度，对蛋白的表达效率产生一定影响，导致双靶点CAR-T 细胞的CAR分子表达率降低，从而增加了CAR-T细胞制作工艺的难度和生产成本的投入，这些劣势并不能忽视。

综上所述，本研究成功设计了一种靶向CD19和CD22的双特异性CAR，并成功获得了相应CAR-T细胞，通过体外肿瘤杀伤实验及小鼠体内抗肿瘤实验证明了该双靶点CAR-T 细胞的安全性和有效性，证明对应的CAR-T细胞可以在有效治疗恶性肿瘤的同时防止免疫逃逸，为后期进一步的临床试验开展提供了数据支撑，具有非常重要的意义。