清肠汤联合美沙拉嗪治疗热盛血瘀型活动期溃疡性结肠炎患者的临床效果及其作用机制

王晓瑜 缪志伟 张耀辉 张春雨 徐 艳

南京中医药大学附属张家港医院脾胃病科，江苏张家港 215600

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是慢性、反复发作性的胃肠道炎症性疾病，现已发展成为全球性疾病[1-2]。2015 年，全球的炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者达到500 万人，包含中国在内的发展中国家发病例数急剧上升，且增长速度超过了西方国家[3-5]。据推测，到2025 年，仅在我国，将会有100 万例患者罹患UC[4]，届时将会对社会公共卫生带来巨大负担。

现阶段，UC 的确切发病机制仍然不明，涉及多个细胞通路，Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）4/肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）6/核因子（nuclear transcrip tion factor，NF）-κB 通路即是最为经典的信号通路之一。UC 发病过程中，机体遇到致病因素侵袭时，先天性免疫应答最先启动，肠黏膜细胞中的TLR4 过度表达，从而激活TRAF6，活化的TRAF6 合成K63 连接的泛素链介导了下游蛋白激酶复合体NF-κB 抑制蛋白激酶亚基α，从而引起IκBα 的磷酸化，并进一步降解，释放NF-κB 进入细胞核，导致机体中的多种致病因子如促炎因子、趋化因子及黏附因子的释放，引起免疫系统的失衡与紊乱，从而引起炎症损伤，诱发UC。由此可见，TRL4/TRAF6/NF-κB 这条信号通路在UC的发病过程中起到至关重要的作用，若能阻断这条通路，可减弱UC 的炎症反应。已有多项实验证明，中草药能够通过调控这一通路，达到改善UC 的治疗作用[6-8]。

经多年临床实践总结，活动期UC 总离不开“热、瘀”两大病理因素，从而总结出经验方——清肠汤，其清热祛湿、活血化瘀、凉血止血，能显著提高UC 患者的治疗有效率[9-10]。本研究通过采用清肠汤联合美沙拉嗪治疗热盛血瘀型活动期UC，观察其临床疗效及对TRL4/TRAF6/NF-κB 的影响，评价清肠汤的治疗效果，探讨其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年10 至2019 年12 月在南京中医药大学附属张家港医院就诊（门诊及住院）的热盛血瘀型活动期UC 患者60 例。按照随机数字表法分为两组，对照组30 例，单用西药治疗；治疗组30 例，在对照组的基础上予清肠汤治疗。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018 年·北京）》[11]制定的UC 活动期诊断标准，且为轻-中度患者（改良Mayo 评分为3～10 分）。

1.2.2 中医诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则》[12]及《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见（2017）》[13]制定热盛血瘀证UC 的中医诊断标准。主症：①腹痛，腹泻，脓血便，血色紫暗或黑；②里急后重；③腹痛灼热；④舌质暗红，或有瘀斑瘀点，苔黄腻。次症：①肛门灼热；②溲赤；③脉弦滑或弦涩。符合主症2 项及次证2 项即可诊断为热盛血瘀证。

1.3 纳入标准

①符合以上中西医诊断标准；②年龄18～65 岁；③签署知情同意书；④经南京中医药大学附属张家港医院伦理委员会审核通过，批准文号为2017KY056。

1.4 排除标准

①妊娠、哺乳期，或正准备妊娠的妇女；②过敏体质及对本研究药物已知成分或其他成分过敏；③有原发性心、肝、肺、肾、血液或影响其生存的严重疾病；④目前正参加其他临床试验。

1.5 研究方法

对照组：美沙拉嗪缓释颗粒：1 g/次，4 次/d（上海爱德发制药有限公司，生产批号：181005）。

治疗组：在对照组方案的基础上，服用清肠汤，方药组成：白头翁10 g、川黄柏10 g、生大黄6 g 后下、败酱草15 g、仙鹤草15 g、地榆炭10 g、煨木香10 g、白及10 g、三七10 g、血竭冲服5 g、生甘草5 g。浓煎200 ml，口服，2 次/d。两组疗程均为3 个月。

1.6 观察指标

分别于治疗前及治疗后1 周各观察记录一次。（1）主要疗效指标：临床疗效。（2）次要疗效指标：①中医证候积分；②Mayo 评分；③肠镜黏膜愈合率；④相关理化指标：肠镜下黏膜组织的免疫荧光染色分析TLR4 表达量；免疫组织化学分析TRAF6、NF-κB 的表达量。

1.7 疗效评价标准

①参照《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见（2017）》[13]：治疗后1 周Mayo 总评分≤2 分，则判定为临床缓解；治疗后1 周Mayo 总评分下降≥30%或≥3 分，且便血评分下降≥1 分，则判定为临床有效；治疗后1 周Mayo 总评分无降低，则判定为临床无效。②中医证候疗效标准参照《中药新药临床研究指导原则》[12]。见表2。③内镜下肠道黏膜愈合标准：参照《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见（2017）》[13]，Mayo 内镜亚评分为0 分或1 分。内镜黏膜愈合率=黏膜愈合人数/总人数×100%。④免疫组化检测结果的判定：结肠组织采用Roche 公司Ventena 全自动免疫组织化学检测仪检测，兔单克隆抗体（抗TRAF6ab33915、抗NFκB p65 ab32536）均购自Abcam 公司。使用Photoshop CS5 数码医学图像分析系统对阳性细胞染色的积分光密度进行计算，结果以光密度（optical density，OD）值表示。⑤免疫荧光染色的测定：TLR4 抗体（ab22048）及荧光二抗山羊抗小鼠IgG H&L（ab150113）均购自Abcam 公司。结肠组织石蜡切片脱蜡后在100℃柠檬酸钠中加热20 min，PBS 洗玻片，5 min 重复3 次，置于0.2% Triton 穿孔2 min，放入5%牛血清中封闭1 h，加入TLR4（1∶100），4℃过夜，PBS 洗玻片，5 min 重复3 次，黑暗中敷荧光二抗（1:500）50 min，PBS 洗5 min，漂洗3 次，加DAPI 封片剂封片，荧光显微镜观察。使用Photoshop CS5 数码医学图像分析系统对阳性细胞染色进行计算。

表2 症状积分标准

1.8 统计学方法

采用SPSS 24.0 对数据进行统计分析，计量资料符合正态分布采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；不符合正态分布则以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，比较采用秩和检验。计数资料以例数或百分比表示，比较采用χ2检验。等级资料比较采用秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床疗效比较

治疗组临床疗效优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组临床疗效比较（例）

2.2 两组治疗前后中医证候积分比较

治疗前，两组中医证候单项积分及总积分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，两组中医证候单项积分及总积分均较治疗前降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组治疗前后中医证候积分比较（分，）

表4 两组治疗前后中医证候积分比较（分，）

2.3 两组治疗前后Mayo 评分比较

治疗前，两组Mayo 评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，两组Mayo 评分均较治疗前降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 两组治疗前后Mayo 评分比较（分，）

表5 两组治疗前后Mayo 评分比较（分，）

2.4 两组内镜黏膜愈合率比较

治疗组黏膜愈合率为86.67%（26 例），对照组为53.33%（16 例）。治疗后治疗组黏膜愈合率高于对照组，差异有统计学意义（χ2＝7.937，P＝0.005）。

2.5 两组治疗前后结肠黏膜TRAF6、NF-κB 表达情况比较

治疗前，两组TRAF6、NF-κB 表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，两组TRAF6、NF-κB 表达情况均较治疗前降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 两组治疗前后结肠黏膜TRAF6、NF-κB 表达情况比较（OD，）

表6 两组治疗前后结肠黏膜TRAF6、NF-κB 表达情况比较（OD，）

注 TRAF：肿瘤坏死因子受体相关因子；NF-κB：核因子-κB

2.6 两组治疗前后免疫荧光TLR4 表达情况比较

治疗前，两组免疫荧光TLR4 表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后两组免疫荧光TLR4表达情况较治疗前降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1～2。

图1 两组治疗前后免疫荧光Toll 样受体表达情况（n=30）

图2 两例患者治疗前后TLR4 免疫荧光表达（免疫荧光，200×）

3 讨论

目前UC 的患者已遍布全球各地，且发病率快速上升。在目前国内医疗资源及社保基金如此紧缺的形势下，UC 将愈发成为我国社会的一大医疗负担。

TLR4/TRAF6/NF-κB 通路是UC 致病过程中关键因素。外来致病因素对机体产生侵袭时，机体首先启动固有免疫，TLR4 的表达被激活，而获得性免疫应答可被活化的TLR4 启动，刺激TRAF6，凭借TRAF6依赖性信号转导途径激活NF-κB。UC 患者肠黏膜受损，肠道中大量的致病菌群可直接接触肠上皮细胞，同时TLR4 阳性的巨噬细胞在受损的肠黏膜聚集，从而触发TLR4/TRAF6/NF-κB 信号通路，导致NF-κB 的磷酸化，引起免疫系统的失衡与紊乱而致病[14-15]。而这些细胞因子又可以反过来激活NF-κB，形成恶性循环，加剧UC 的炎症损伤[16-18]。因此阻断TLR4/TRAF6/NF-κB 这一信号通路，将减弱UC 的炎症反应，起到治疗作用。

在历代中医人的不懈努力下，中医药治疗UC 的临床疗效在国内已得到广泛认可[19-20]。中医学认为，UC 病位在大肠，与脾、肝、肾、肺诸脏功能失调有关[13,21-22]，其致病因素有湿热、瘀毒、痰浊、气滞、血瘀等，而活动期总离不开湿热、瘀血。国医大师徐景藩教授认为，UC 发病关键为“脾虚湿热夹瘀，寒热错杂，肝、脾、肾同病”[23-24]。沈洪教授在此基础上主张UC 活动期为气血瘀热搏结，血败肉腐，内溃成疡[25]。广东省名中医劳绍贤教授亦提出，活动期UC 为血瘀化热而成溃疡[26]。张声生教授也认为UC 病变过程中始终贯穿寒热错杂、气血凝滞[27]。可见，UC 活动期以标实为主，病理因素主要为湿热、血瘀。本研究参考以上名医的学术观点，结合临床经验，提出从湿热、血瘀论治，制定验方清肠汤，方以白头翁汤化裁，共奏清热化湿、活血化瘀、凉血止血之功。

本研究结果显示，清肠汤能有效改善患者的相关临床症状，降低Mayo 评分，抑制肠道的炎症活动，同时还能促进结肠黏膜愈合，对改善患者的长期预后有重要意义。清肠汤联合美沙拉嗪能弱化TLR4 免疫荧光表达，降低TRAF6 和NF-κB 免疫组织化学的表达水平，且较单独使用美沙拉嗪更为有效，说明清肠汤能通过干预TLR4/TRAF6/NF-κB 信号通路，纠正UC患者的免疫系统失衡，促进结肠黏膜修复，这可能是其发挥抗炎作用的机制之一。