茯苓多糖对大鼠免疫功能的影响

王 萍，王玉堃，王尚明，于天明，尹贻奎，李梁梁，王玉霞，许方方，谭庆强，李凤华

（山东迅达康兽药有限公司，山东 济南 250300）

茯苓是多孔菌科茯苓属真菌茯苓Poria cocos（Schw．）Wolf的干燥菌核，具有健脾宁心、利水渗湿等功效[1]。茯苓中含有三萜类、甾醇类、多糖类等多种化学成分，其中多糖类为茯苓的主要活性成分之一[2]。茯苓多糖具有免疫调节[3,4]、抗炎[5]、抗肿瘤[6]及抗氧化[7]等药理作用。本研究用环磷酰胺制备免疫低下大鼠模型，以茯苓多糖给药，通过考察其对免疫低下模型中大鼠免疫功能的影响，研究茯苓多糖对大鼠的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茯苓多糖 茯苓多糖由山东迅达康兽药有限公司提供。

1.1.2 试验动物 60只SPF级SD雄性大鼠，体重200±20 g，购于济南朋悦动物繁育有限公司。实验动物许可证编号SCXK（鲁）20190003。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠免疫球蛋白G（IgG）ELISA试剂盒、大鼠白细胞介素2（IL-2）ELISA试剂盒、大鼠白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒和大鼠γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司；盐酸左旋咪唑、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI-1640培养基、PBS缓冲液购自Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清、青霉素、链霉素购自Hyclong公司；酶标仪、恒温培养箱均购自上海精密仪器仪表公司；倒置荧光显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茯苓多糖体外免疫活性试验 （1）巨噬细胞增殖试验：制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液[8]，台盼蓝染色检测细胞生存率大于90 %，用RPMI1640完全培养基（含1 % 青霉素、链霉素双抗与10 % 胎牛血清）调整悬液细胞浓度为1×106个/ml。96孔细胞培养板内每孔接种100 μl该悬液细胞，取100 μl茯苓多糖加入至上述96孔细胞培养板内，使多糖最终浓度为1 000、500、250、125、62.5 μg·ml-1。同时空白对照组加等体积的细胞培养液，每个浓度重复3个孔，取平均值。在37.0 ℃，5 % CO2培养箱中培养44 h，采用MTT法检测570 nm处吸光度。（2）脾脏细胞增殖试验：剥离多余脂肪，放在200目筛上一边研磨一边用PBS冲洗，过滤，收集研磨液并离心（4 ℃、3 500 r/min，30 min），将所得沉淀用PBS漂洗3次后得到大鼠脾脏细胞[9]。再用RPMI-1640完全培养基调节细胞浓度至1.0×106个/ml，96孔板内每孔接种100 μl该悬液细胞。取茯苓多糖在96孔细胞培养板内由1 mg/ml依次2倍稀释至62.5 μg/ml，同时空白对照组加100 ml细胞培养液，每个浓度重复3个孔，取平均值。然后进行细胞培养及OD值测定。1.2.2 茯苓多糖体内免疫活性试验 试验动物适应性饲养7 d后，取60只大鼠，随机分为6组，每组10只，6组分别为空白对照组、模型对照组、免疫对照组（盐酸左旋咪唑100 mg·kg-1）、茯苓多糖低剂量组（100 mg·kg-1）、茯苓多糖中剂量组（200 mg·kg-1）、茯苓多糖高剂量组（400 mg·kg-1）。空白对照组注射生理盐水，其余各组腹腔注射80 mg·kg-1的环磷酰胺，1次/d，连续3 d，建立免疫低下模型[10]。各组连续给药7 d，末次给药24 h后，大鼠心脏采血并静置30 min，4 ℃、3 500 r/min离心30 min，取上清液，用ELISA法测定血清中IgG抗体及细胞因子（IL-2、IL-6和IFN-γ）含量。采血完成后脱颈椎处死大鼠，摘取完整脾脏和胸腺，剔除筋膜及脂肪组织，用滤纸片吸干脏器的表面血污，并分别称定质量，计算脾脏及胸腺指数。脾脏指数（%）=脾脏质量（mg）/体质量（g）×100 %；胸腺指数（%）=胸腺质量（mg）/体质量（g）×100 %。

2 结果与分析

2.1 茯苓多糖对大鼠巨噬细胞增殖的影响

如表 1所示，茯苓多糖浓度为 62.5～1 000 μg·ml-1时淋巴细胞的OD值均大于空白对照组（P＜0.05），表明在此浓度区间内茯苓多糖对大鼠巨噬细胞的增殖具有刺激作用，且呈剂量依赖性。浓度为1000 μg·ml-1时OD值最大，说明在62.5～1 000 μg·ml-1浓度范围内此浓度的茯苓多糖对大鼠腹腔巨噬细胞增值的刺激作用最大。

表1 不同剂量茯苓多糖大鼠巨噬细胞增值的检测结果

2.2 茯苓多糖对大鼠脾脏细胞增殖的影响

茯苓多糖对大鼠脾脏细胞增殖的影响结果见表2，从表2可以看出，茯苓多糖浓度在62.5～1 000 μg·ml-1时吸光度均大于空白对照组，吸光度随着浓度的增大而增大，见表2。茯苓多糖浓度为250 μg·ml-1、500 μg·ml-1、1 000 μg·ml-1时对脾脏细胞的刺激作用比较明显（P＜0.05）。浓度为62.5 μg·ml-1、125 μg·ml-1时吸光度虽较空白对照组相比增加，但是没有统计学意义（P＞0.05）。总体结果说明，茯苓多糖能刺激大鼠脾脏细胞的增殖。

表2 不同剂量茯苓多糖对大鼠脾脏细胞增殖结果

2.3 茯苓多糖对大鼠血清IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ的影响

如表3所示，模型组大鼠血清IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ含量低于空白对照组，说明建模成功（P＜0.01）。与模型组相比，免疫对照组、茯苓多糖高、中、低剂量组测得IgG抗体及细胞因子含量均高于模型组，低于空白对照组（P＜0.05）。说明多糖可以促进免疫低下鸡血清中IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ含量。

表3 大鼠血清IL-2、IL-6、IgG、IFN-γ含量的检测

2.4 茯苓多糖对大鼠免疫器官指数的影响

模型组胸腺指数、脾脏指数低于空白对照组，差异极显著（P＜0.01）。免疫对照组、茯苓多糖高、中、低剂量组胸腺指数、脾脏指数均高于模型组，差异比较显著（P＜0.05）。茯苓多糖组中，中剂量组恢复胸腺指数效果较好；高剂量组恢复脾脏指数效果较好，见表4。

表4 各组免疫器官指数的变化

3 讨论

茯苓多糖是茯苓的主要药用活性成分，具有免疫调节、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等作用[11]。其中免疫调节活性是中药多糖研究领域的热点之一。茯苓多糖在体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫方面均有显著的修复或增强作用[12]。胸腺和脾脏分别作为体内中枢和外周的主要免疫器官，在维持机体正常免疫功能方面发挥重要作用。正常的胸腺功能是确保机体成熟T细胞数量的基础[13]。脾脏则是具有免疫活性的T、B细胞移居和受到抗原刺激后产生免疫应答的重要场所，而且可以增强巨噬细胞的吞噬功能[14]。因此，免疫器官的发育情况与机体免疫功能的强弱密切相关。脾脏指数和胸腺指数的降低可显示免疫功能的降低。本试验检测了各组大鼠免疫器官指数，结果显示茯苓多糖能提高免疫抑制大鼠免疫器官发育，提高免疫功能。巨噬细胞在宿主防御反应中发挥重要作用，是非特异性免疫的主要参与者[15]，脾脏是重要的免疫器官，两者的细胞数量能一定程度上反映机体的免疫应答能力和水平[16-17]。本试验研究结果表明，茯苓多糖对淋巴细胞、脾脏细胞的增殖具有刺激作用，浓度越高，刺激作用越强。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是介导体液免疫的主要的免疫球蛋白，同时也是血清学诊断检测的主要免疫球蛋白[18]；细胞因子IL-2可促进淋巴细胞生长、增殖、分化；IL-6诱导B细胞和T细胞的增殖分化；IFNγ具有促进抗原呈递、提高NK细胞、巨噬细胞和溶酶体活性的作用[19]。因此，通过对IgG、IL-2、IL-6和IFN-γ水平的检测，可以反映出机体的免疫状况。本试验结果表明，茯苓多糖可通过提高大鼠血清中IgG、IL-2、IL-6和IFN-γ含量，进而提高大鼠免疫力。

4 结论

茯苓多糖主要通过刺激巨噬细胞、脾脏细胞增殖，促进IgG抗体及IL-2、IL-6、IFN-γ等细胞因子的分泌，增加免疫器官指数，从而提高了SD雄性大鼠的免疫力。