老年男性血清Gremlin-1、dp-ucMGP与骨质疏松的相关性*

曾小洁 范小雪 谢玉玲

(海南医学院第一附属医院 1.发热门诊；2.体检中心；3.创面修复科，海南 海口 570100)

世界卫生组织(WHO)将骨质疏松症定义为一种以低骨量和骨组织微结构退化为特征的疾病，导致骨脆性增加和骨折风险[1-2]。近几十年来，由于社会老龄化，骨质疏松症的发病率上升，全世界约2亿骨质疏松及约890万骨质疏松骨折患者[3]。骨质疏松骨折和脊柱后凸是导致老年患者生活质量和生存率下降的最重要因素[4-5]。Gremlin-1是早期肾功能障碍的敏感指标，也是心血管疾病、糖尿病相关死亡率和全因死亡率的独立预测指标[6]。脱磷-未羧化-基质Gla蛋白(dp-ucMGP)缺失胚胎表现出四肢骨骼缺陷，这是早期肢芽模式缺陷的结果，不对软骨细胞或成骨细胞造成直接影响，然而，在发育后期dp-ucMGP在成骨细胞中表达，表明其参与胚胎骨骼发生，可能与骨代谢相关[7-8]。目前缺乏有关Gremlin-1、dp-ucMGP与骨质疏松的相关性研究。因此，本研究拟探讨老年男性血清Gremlin-1、dp-ucMGP与骨质疏松的相关性，为骨质疏松的治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入我院2019年1月～2020年12月确诊的139例老年男性骨质疏松患者为病例组。纳入同期本院男性健康体检者142例为对照组。本研究经我院医学伦理协会批准(伦审号：2019003)，同时患者及对照组签署知情同意书。纳入标准：①男性，年龄≥65岁。②通过定量超声在跟骨处测量的骨状态数据，T-score≤-2.5[9]。排除标准：类固醇使用史；严重的骨关节炎；髋部和脊柱骨折史；骨质疏松症、糖尿病、肾病和心脏病治疗史。

1.2 方法

1.2.1 血清样品获取 将空腹静脉血样品收集到常规采血管中并使其凝结。以2000g离心后，分离出血清样品并等分冷冻。血清样品在-20～-80℃冷冻保存(-20℃保存5天，-80℃保存12个月)。

1.2.2 常规血生化指标测定 贝克曼AU-680全自动生化仪测定血清白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、总蛋白(TP)水平。ALB、HDLC、LDLC、TC、TG、TP试剂盒购于中生北控，批号分别为SD-5696、1254、4526、0215、9851、6512。

1.2.3 骨密度(BMD)测定 使用DXA扫描(Hologic，QDRInc，Bedford，MA，USA)评估腰椎和髋部BMD(g/cm2)，确定T分数。

1.2.4 血清Gremlin-1、dp-ucMGP水平测定 Gremlin-1水平检测：使用MicroVueGremlin-1人ELISA试剂盒测量血清Gremlin-1水平。Gremlin-1是一种微量滴定条形式的免疫测定，使用单克隆抗Gremlin-1抗体包被在条上以捕获样品中的Gremlin-1。用对硝基苯基磷酸酯(pNPP)底物检测捕获的Gremlin-1的酶活性。该测定(使用人ELISA试剂盒)的性能特征最低。与参考值相比，本研究的检测限为100 ng/mL，循环中的CV=5.0%～5.8%，循环间的CV=4.8%～5.2%、140.2～420.7 ng/mL(MicroVueTMBSAP；MDSSGmbH，德国汉诺威)。dp-ucMGP浓度检测：使用两步MicroVuedp-ucMGP测定法测量dp-ucMGP浓度。将重新配制的标准品和对照品与样品稀释剂一起加入包被的微孔板孔中。血清中天然存在的无活性dp-ucMGP片段可能会干扰生理样品中dp-ucMGP的检测。该测定通过使用两种不同的单克隆抗体避免了无活性片段的影响。检测性能的特点是最低检测限2000 ng/mL，运行内CV=2.2%～3.6%，运行间CV=3.0%～4.6%。

1.2.5 骨代谢指标测定 酶联免疫吸附法测定血清I型胶原氨基酸端延长肽(Type I procollagen amino-terminal peptide，PINP)、β-胶原特殊序列(β collagen specific sequences，β-CTX)、N-端骨钙素(N-terminal osteocalcin，N-MID)、25-羟维生素D(25-(OH)D)、骨钙素(OC)水平。25-(OH)D、PINP、β-CTX、N-MID、OCELISA试剂盒购于上海博湖生物科技有限公司，批号分别为54896.36、41589.54、47859.36、40269.36、59874.63。

2 结果

2.1 两组基础资料比较 两组年龄、ALB、HDLC、LDLC、TC、TG、TP、收缩压、舒张压、BMI等基础资料方面的比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组基础资料比较

2.2 两组Gremlin-1、dp-ucMGP水平比较 病例组血清Gremlin-1、dp-ucMGP水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组Gremlin-1、dp-ucMGP水平比较

2.3 两组骨代谢指标水平比较 病例组血清PINP、β-CTX水平明显高于对照组，血清25-(OH)-D、N-MID、OC以及BMD明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组骨代谢指标水平比较

2.4 Gremlin-1、dp-ucMGP与各变量的相关性分析 Gremlin-1、dp-ucMGP与PINP、β-CTX呈负相关，与25-(OH)D、N-MID、BMD、OC呈正相关(P<0.05)，见表4。

表4 Gremlin-1、dp-ucMGP与各变量的相关性分析

2.5 Gremlin-1、dp-ucMGP预测老年男性骨质疏松的ROC曲线 受试者工作特征曲线显示，Gremlin-1、dp-ucMGP预测老年男性骨质疏松的ROC曲线下面积分别为0.859(95%CI：0.768～0.943)、0.833(95%CI：0.748～0.924)，两者诊断骨质疏松的灵敏度、特异度相近(2=1.563、1.215，P>0.05)，见表5、图1。

表5 Gremlin-1、dp-ucMGP预测老年男性骨质疏松的ROC曲线

图1 Gremlin-1、dp-ucMGP预测老年男性骨质疏松的ROC曲线

2.6 老年男性发生骨质疏松多因素Logistics回归分析 以老年男性是否发生骨质疏松为因变量(是=1，否=0)，单因素分析有意义的因素为自变量进行多因素Logistic逐步回归分析，结果显示，Gremlin-1、dp-ucMGP、25-(OH)D降低，β-CTX升高均为老年男性发生骨质疏松的危险因素(OR=2.18、4.14、5.62、3.06，P<0.05)，见表6。

表6 老年男性发生骨质疏松的多因素Logistic回归分析

3 讨论

之前有许多研究涉及骨质疏松症的生物标志物和预测因子，其中25-(OH)-D、PINP、β-CTX、N-MID、BMD、OC已被确定为敏感且稳定的检测骨质疏松症的骨生物标志物[10-16]。Gremlin-1是一种由122个氨基酸组成的小蛋白质，属于木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶抑制剂的胱抑素家族[17]。Gremlin-1广泛分布并存在于大多数体液中，其主要用作蛋白酶抑制剂，并且是组织蛋白酶D和弹性蛋白酶的蛋白水解降解目标；Gremlin-1水平与肾小球滤过率相关，是肾脏健康的重要标志，同时也是糖尿病和慢性肾病进展的决定因素[18-19]。已有研究表明，Gremlin-1与破骨细胞之间存在关系，其通过涉及RANK信号传导的细胞内机制直接靶向破骨细胞祖细胞来减少破骨细胞的形成[20]。本研究结果显示，病例组血清Gremlin-1水平明显低于对照组(P<0.05)；且Gremlin-1与PINP、β-CTX呈负相关，与25-(OH)D、N-MID、OC、BMD呈正相关(P<0.05)，与上述研究结果一致。提示Gremlin-1与骨质疏松症密切相关。骨质疏松症中破骨细胞分化增加，破骨细胞祖细胞吸收Gremlin-1，从而导致血清Gremlin-1水平降低[21]；其次，在骨质疏松症中，Gremlin-1被抑制可能会发生破骨细胞分化，从而导致胱抑素C表达的相应降低[22]。这些机制可以解释为什么血清Gremlin-1在骨质疏松症患者中降低。

研究表明，dp-ucMGP与骨代谢有一定关联性：dp-ucMGP显著下调并与绝经后骨质疏松女性血清中的腰椎BMD呈正相关[23]；dp-ucMGP通过靶向和调节Runx2表达来抑制成骨细胞生成[24]；在成骨细胞系MC3T3中，低表达的dp-ucMGP直接靶向Runx2基因3'-UTR，抑制碱性磷酸酶的产生和成骨细胞的分化；dp-ucMGP在用伊班膦酸盐处理的成骨细胞样牙周膜干细胞中上调[25-26]；雌激素缺乏与dp-ucMGP低表达相关，而dp-ucMGP低表达可以通过削弱人间充质干细胞的成骨分化来诱导绝经后骨质疏松症[27]。体外实验表明，dp-ucMGP在RANKL/M-CSF诱导的RAW264.7和THP-1细胞中呈时间依赖性上调，表明dp-ucMGP在破骨细胞生成过程中上调。此外，dp-ucMGP的过表达显著增加了NFATc1、c-Fos和TRAP的蛋白质表达，并显著增加了RANKL处理的RAW264.7和THP-1细胞中TRAP阳性细胞的数量[28]。相反，破骨细胞主要负责骨吸收，破骨细胞的分化通过不同的基因表达受到各种过程的调节[29]，dp-ucMGP敲低显示出相反的结果。本研究在老年男性人群中发现，病例组血清dp-ucMGP水平明显低于对照组(P<0.05)；且dp-ucMGP与PINP、β-CTX呈负相关，与25-(OH)D、N-MID、OC、BMD呈正相关(P<0.05)。提示骨质疏松症老年患者血清dp-ucMGP降低，dp-ucMGP与骨代谢密切相关。同时本研究通过多因素Logistic回归分析发现，Gremlin-1、dp-ucMGP降低均为老年男性发生骨质疏松的危险因素，同时ROC曲线及灵敏度、特异度分析提示Gremlin-1、dp-ucMGP诊断骨质疏松的临床价值较高。

4 结论

老年男性骨质疏松症患者血清Gremlin-1、dp-ucMGP降低，且Gremlin-1、dp-ucMGP与骨代谢密切相关；Gremlin-1、dp-ucMGP降低均为老年男性发生骨质疏松的危险因素。