丹皮酚对5-FU诱导的小鼠肠道黏膜损伤的保护作用及对其抗肿瘤活性的影响*

韩成龙 李苏阳 韩雅萌

(1.四川大学华西药学院，四川 成都 610041；2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230000；3.蚌埠医学院临床医学系，安徽 蚌埠 233030)

5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是治疗胃肠道癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症最常用的抗肿瘤药物[1]。临床上5-FU的剂量通常为10～20 mg/kg，药效可持续5～10 d[2]。然而，5-FU可引起一系列副作用，这其中就包括肠道功能损伤。据报道，大约80%接受化疗的癌症患者会发生肠黏膜炎[3]。丹皮酚是从毛茛科植物牡丹的根皮中提取出来的活性成分。丹皮酚具有镇痛、抗炎、解热、抗氧化及保护心脑血管等广泛的药理活性[4]。研究发现，丹皮酚可增强化疗药物对肝癌和结肠癌的抑制作用[5-6]，然而丹皮酚对化疗过程中肠黏膜的保护作用并不清楚。本实验通过腹腔注射5-FU建立小鼠肠黏膜炎模型，研究丹皮酚对小鼠肠道黏膜损伤的保护作用及对其抗肿瘤活性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SD成年雄性C57BL/6J小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，饲养在SPF级动物房内，室温(23.00±1.00)℃，昼夜循环12 h。丹皮酚购自安徽宣城百草植物工贸有限公司，纯度>98%(批号:N0980)。5-FU购自天津金耀氨基酸有限公司(批号:1803091)。本研究通过动物伦理委员会审核批准。

1.2 分组 小鼠随机分为对照组(Con组，12只)、5-FU注射组(5-FU组，12只)、丹皮酚25 mg/kg组(5-FU +Pae 25 mg/kg组，13只)、丹皮酚100 mg/kg组(5-FU+Pae 100 mg/kg组，13只)。小鼠均在在饲养环境下适应一周。5-FU以及5-FU+ Pae组小鼠每天腹腔注射 5-FU(50 mg/kg)一次，连续6 d，Con组注射等体积生理盐水。Pae组小鼠每天灌胃给予对应浓度丹皮酚，每天两次，连续6 d，Con组和5-FU组小鼠每天灌胃等体积生理盐水。7 d后小鼠经过量麻醉处死进行相应组织或生化检测。

1.3 成瘤实验 所有小鼠在接受药物注射前接受皮下注射结肠癌细胞(人结肠癌细胞株 LS174T 购于中国科学院生物研究所)。取对数生长期结肠癌细胞，制成细胞悬液，随后接种在小鼠腹股沟处。小鼠在第二天接受5-FU注射或丹皮酚治疗。实验接受后过量麻醉处死小鼠，取肿瘤组织称重。

1.4 HE染色观察小鼠肠道形态 小鼠过量乙醚麻醉后快速打开腹腔，暴露出肠道。去小鼠肠道组织后，生理盐水冲洗并快速固定于4%福尔马林缓冲液中，24 h后进行石蜡包埋处理。用切片机制作4 μm厚度小肠组织切片，HE染色观察小肠绒毛形态学变化情况。

1.5 免疫组化染色观察小鼠小肠腺细胞 小肠组织切片通过二甲苯中脱石蜡后浸泡乙醇水化，随后100℃煮沸1 h。切片在H2O2处理45 min以分解内源性过氧化物酶。PBS洗涤后，切片以10%山羊血清37℃下封闭1 h。随后加入一抗(鼠抗anti-TUNEL 1∶500，鼠抗anti-Cleaved caspase-3 1∶500)(Sigma，美国，A0835)37℃孵育2 h后4℃过夜。第二天切片用二抗(1∶200)(Sigma，美国，A2268)37℃孵育1 h，DAB显色。随机选取3个视野，采用Image J软件统计。

2 结果

2.1 丹皮酚对5-FU注射后小鼠体重的影响 实验结果显示，相比于Con组，在5-FU注射后第3天、第6天和第9天小鼠体重显著降低(P<0.001)。而相比于仅接受5-FU注射的小鼠，丹皮酚可显著增加小鼠5-FU注射后体重，在100 mg/kg(P<0.001)浓度下效果最为明显。见图1。

图1 丹皮酚对5-FU注射后小鼠体重的影响

2.2 丹皮酚对5-FU注射后小鼠肠道形态学变化及小肠绒毛高度的影响 HE染色结果显示，Con组小鼠肠道无水肿或充血，5-FU注射后小鼠肠道被严重破坏，并伴有明显的水肿和充血。而丹皮酚分别处理25、100 mg/kg可明显改善肠道情况，在100 mg/kg时未观察到明显的水肿或出血(图2A)；5-FU注射后小鼠小肠绒毛高度明显降低(图2B)，小肠腺数量明显下降(图2C)，而丹皮酚可显著逆转5-FU注射小鼠小肠绒毛的形态变化，使小肠绒毛升高并增加小肠腺数量。

图2 丹皮酚对5-FU注射后小鼠肠道形态学变化影响

2.3 丹皮酚对5-FU注射后小鼠小肠腺细胞凋亡的影响 实验结果显示，5-FU注射后小鼠小肠腺中TUNEL和Cleaved caspase-3染色程度明显加重，说明细胞凋亡程度上升。而丹皮酚在25 mg/kg(P<0.05)和100 mg/kg(P<0.01)处理后可显著降低 TUNEL和Cleaved caspase-3在小肠腺的表达，见图3。因此，丹皮酚可显著降低5-FU引起的小肠腺细胞凋亡。

图3 丹皮酚对5-FU注射后小鼠小肠腺细胞凋亡的影响

2.4 丹皮酚对5-FU抗肿瘤的影响 与Con、5-FU组相比，5-FU+100 mg/kg丹皮酚组肿瘤显著缩小，见图4。这提示5-FU可显著抑制瘤体生长。

图4 丹皮酚对5-FU抗肿瘤的影响

3 讨论

5-FU是临床常用的化疗药物，其口服吸收率较低，临床主要采取静脉注射。然而5-FU可导致肠道损伤，主要表现为肠屏障功能破坏，小肠腺细胞凋亡，肠细胞增殖减少[7]。因此寻找对抗5-FU对肠道功能破坏的药物至关重要。丹皮酚是一种具有多种临床疗效的中药成分，其在加强化疗药物抗肿瘤活性方面的作用受到越来越多的关注[5,8]。但关于丹皮酚对5-FU诱导的肠道黏膜损伤的保护作用尚未有报道，鉴于此，本实验主要集中在丹皮酚对5-FU诱导肠黏膜损伤的保护作用。

小肠是哺乳动物消化吸收的主要器官，其功能受损后直接影响能量来源，导致体重下降[9]。因此我们首先研究了丹皮酚对5-FU注射后小鼠体重变化的影响。结果显示，在注射5-FU 9天后，小鼠体重显著降低，而丹皮酚处理后可恢复小鼠体重，说明丹皮酚对5-FU引起的小肠损伤可能具有一定的保护作用。既往研究报道显示小肠管壁结构特点是管壁有环形皱襞，黏膜有许多绒毛[10]，这些环状皱襞和绒毛扩大了黏膜的表面积，黏膜下层中有由表层上皮下陷形成的肠腺，开口于黏膜表面，分泌肠液，绒毛和小肠腺与小肠的消化和吸收功能关系密切[11-12]。由于5-FU对DNA损伤及细胞毒性作用，在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，也诱导正常细胞凋亡，改变其生物学特性，并诱导正常细胞或肿瘤细胞产生大量炎症因子或氧化因子，进而损伤包括肠上皮细胞在内的细胞损伤[13-14]。因此我们观察了丹皮酚对小鼠肠道形态以及组织学变化的影响。结果显示，丹皮酚可明显降低小肠水肿程度或出血，并使小肠绒毛升高，增加小肠腺数量。小肠腺主要由柱状细胞、杯状细胞和潘氏细胞构成，起着合成和释放消化酶的作用[15]。研究表明5-FU引起的肠损伤通常伴有小肠腺细胞的凋亡[16]。因此随后我们通过免疫组化实验研究了丹皮酚对小肠腺细胞凋亡的影响，结果显示，丹皮酚可显著降低小肠腺细胞凋亡程度。说明丹皮酚对5-FU引起的小肠损伤具有保护作用。

丹皮酚具有广泛的药理特性[17]，其中包括抗肿瘤特性[18]，如抗卵巢癌[19]、乳腺癌[20]、肝癌[21]、膀胱癌[22]等，抗肿瘤机制主要包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、促进抑癌基因表达、增强机体免疫力、阻滞细胞周期等[23]。本研究通过成瘤实验研究了丹皮酚对5-FU抗肿瘤活性的影响，发现丹皮酚对结肠癌细胞具有抑制作用，并且可增强5-FU抗肿瘤特性。

4 结论与启示

本研究发现丹皮酚可通过抑制小肠腺细胞凋亡降低5-FU对小鼠黏膜损伤的影响，并可增强其抗肿瘤活性，为对抗5-FU损伤肠道的副作用提供了新的干预手段，但具体作用机制仍需进一步研究加以验证。