加味芩桂术汤联合奥氮平对糖尿病大鼠心肌纤维化及核因子κB、结缔组织生长因子表达的影响

蔡素华，任礼锡

(广州中医药大学金沙洲医院药学部，广东 广州 510168)

糖尿病心肌病属于糖尿病患者常见并发症之一，疾病发病因素上，细胞学病变以及心肌细胞间纤维沉积属于引起心脏舒张功能损伤，糖尿病心肌病的关键因素[1]。核因子κB(NF-κB)几乎可以在所有的动物细胞中发现，主要是参加细胞对外界刺激的响应，在细胞炎性反应以及免疫应答过程中起到关键性作用，若NF-κB错误常容易引起自身免疫疾病[2]。结缔组织生长因子(CTGF)则是近年来新发现的一种致纤维化生长因子，属于多组织器官纤维化形成过程的重要介质。对糖尿病的患者，显示奥氮平除了具有显著抗精神病的作用，而且有潜在的器官保护作用[3]。加味芩桂术汤是一种活血宁心、健脾利湿及温阳化饮的治疗药物，可降低肺动脉高压及改善心功能，而对于应用加味芩桂术汤联合奥氮平对延缓糖尿病心肌病的相关机制却有待进一步的研究[4]。本次研究中，建立了糖尿病大鼠模型，分析了应用加味芩桂术汤联合奥氮平对大鼠心肌纤维化、NF-κB以及CTGF表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1材料:选择70只雄性Wistar大鼠，均由南京军区总院实验动物中心提供。对所有的大鼠均是建立模型，主要是给予大鼠进行10h的禁食，然后单次经腹腔内注入用0.1%mmol/L无菌柠檬酸缓冲液配制的STZ给予单次腹腔注射，注射量为50 mg/kg。注射药物72 h后取尾静脉进行血糖的测定，测定血糖水平≥16.7 mmol/L及选取为糖尿病大鼠。将大鼠分成四组，即正常对照组(n=10)，糖尿病大鼠分成模型组(n=20)、奥氮平组(n=20)、加味芩桂术汤联合奥氮平组(n=20)。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2试剂:美国Sigma公司生产的链脲佐菌素；武汉博士德公司生产的NF-κB多克隆抗体；美国Bi Vision公司生产的CTGF多克隆抗体；申能博才生化公司生产的蛋白提取试剂盒。

1.3用药方法:正常对照组给予注射等量柠檬酸缓冲液；模型组每天予以同体积生理盐水灌胃；奥氮平组每天以5 mg/kg灌胃；加味芩桂术汤联合奥氮平组每天以5 mg/kg奥氮平联合5 mg/kg加味芩桂术汤灌胃(基础组方：丹参、黄芪、茯苓各30 g，葶苈子、白术、桂枝各15 g，桔梗、陈皮、大腹皮、川芎各10 g，酒军、麻黄各8 g，甘草6 g。辨证加减，对紫绀严重者加泽兰20 g；气虚乏力者加人参10 g；腹胀纳差者加厚朴15 g；痰多咯痰不爽者加莱菔子5 g、枳实5 g、半夏5 g。药物加水浓煎后装袋)。各组小鼠用药时间均是12周，在整个实验期间所有的大鼠均予以标准饮食喂养，避免应用胰岛素。

1.4观察指标:所有的大鼠均在用药12周后称重，然后将大鼠处死并且收集3 ml的腹主静脉血液，检测血糖以及糖化血红蛋白水平，打开大鼠胸腔并迅速取出心脏，应用冰盐水冲洗及剥离，滤干水分并且置于电子天平上称重。①心肌纤维化：主要观察心肌超微结构，主要是采取电镜检查，选择规格为1 mm3大小心室肌组织，置入到3%的戊二醛中进行固定，之后用1%饿酸固定1 h，丙酮逐级脱水，然后应用透射电镜进行观察。②NF-κB检测：常规制作石蜡切片，按规范程序脱蜡，应用3% H2O2做灭活处理，微波抗原修复及BSA封闭液封闭，加NF-κB多克隆抗体，置入冰箱中过夜并加羊抗兔IgG，加入酶标记物及进行DAB显色，脱水后封片。借助Leica图像系统，在光学显微镜的帮助下放大400倍，每一张切片均随机选择5个视野获取图像，应用图像分析系统计算各图像吸光度值，吸光度值(D)=阳性区域总面积×阳性区域平均吸光度，5个视野图像均值为各切片D值。③CTGF：选取大约100 mg心肌组织应用冰冷PBS连续漂洗2次，眼科剪碎并置入匀浆器，即刻加蛋白提取缓冲液，高速组织匀浆，冰上静止30 min，经12 000次/min的速度持续离心10 min，选取上清液做蛋白定量测定，电泳、变性及电转膜，CTGF抗体进行Western印迹分析，借助DAB显影方式，借助生物凝胶图像分析系统扫描定量总半定量分析。

2 结果

2.1心肌纤维化:电镜下观察模型组的大鼠在心肌间质内部可见大量的胶原纤维分布，心肌细胞排列紊乱并且肌原纤维呈现灶性溶解，肌丝扭曲且断裂，线粒体明显肿胀及增多。奥氮平大鼠左室心肌组织改变较模型组轻，细胞排列比较整齐，可见T管系统略微扩张，线粒体大小比较一致及排列规整，间质内胶原堆积减少。加味芩桂术汤联合奥氮平组大鼠左室心肌细胞改变较奥氮平组明显减轻，细胞排列整齐，肌原纤维断裂，T管系统未见扩张。

2.2NF-κB、CTGF表达:在各组大鼠的NF-κB、CTGF表达情况上，模型组>奥氮平组>加味芩桂术汤联合奥氮平组>正常对照组，两两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠NF-κB、CTGF表达情况比较

3 讨论

糖尿病是一种常见的慢性疾病，随着生活方式及饮食方式的改变，疾病发病率不断升高，这严重影响患者生活质量及威胁生命健康[5]。糖尿病的典型表现为高血糖，若持续处在高血糖状态可增加各种心血管事件的发生率，因此研究糖尿病与心肌指标的联系对于疾病的治疗有积极意义[6]。

本次研究中，纳入了大鼠作为研究资料，对大鼠分成非糖尿病及糖尿病，并且糖尿病大鼠也根据治疗方式不同分成了三组。结果显示在心肌纤维化上，经12周的治疗后，同模型组的大鼠进行对比，奥氮平组、加味芩桂术汤联合奥氮平组均在电镜下可见间质纤维化减轻，心肌纤维排列整齐，线粒体水肿明显减轻，且以联合治疗的小鼠改变明显。说明加味芩桂术汤联合奥氮平可改善糖尿病心肌纤维化情况，推测可能是来讷河药物具有减轻胶原聚集作用。加味芩桂术汤中的主要功效是活血宁心、健脾利湿及温阳化饮等，对其中的一些药物经现代药理学研究也显示应用黄芪可以促进慢性肺心病的T细胞功能，降低肺动脉压及减轻右心前负荷，川芎有助于松弛血管平滑肌及扩张肺血管，降低肺动脉高压[7]。此外本次研究结果也显示，经过12周的干预治疗后，加味芩桂术汤联合奥氮平组在NF-κB、CTGF表达水平上明显比模型组与奥氮平组更低，数值同未建立糖尿病模型的正常对照组一致率高，推测原因是应用加味芩桂术汤联合奥氮平的方式可以有效调节NF-κB，以直接或者是间接方式对下游的靶基因如CTGF等细胞因子进行抑制，从而起到有效抵抗心肌纤维化的作用[8]。加味芩桂术汤的用药上，经现代药理研究证实促血管紧张的方式，调节CTGF的活性，抑制大鼠CTGF表达及改善大鼠心肌纤维化，延缓疾病心肌病变的持续进展。

综上所述，对于糖尿病大鼠，使用加味芩桂术汤联合奥氮平的给药治疗方式，可以通过有效调节心肌NF-κB、CTGF表达的作用，有效改善心肌纤维化，减轻心脏负担，如此可为糖尿病心肌病变治疗提供可靠依据及参考。