人参根系分泌物中有机酸及皂苷对人参病原菌与生防菌的化感差异研究

杨莉，于俐，孙卓，张桐毓，张阳，杨利民*

（1.吉林农业大学生态恢复与生态系统管理省部共建国家重点实验室培育基地，长春 130118；2.延边特色产业发展中心，吉林延吉 133000）

植物根系分泌物是植物间化感作用重要的载体物质，也是植物和其他有机体之间信息传递的重要媒介[1]。越来越多的研究表明，根系分泌物不仅能够影响植物生长，还可作为土壤微生物生长和繁殖的碳源、能源，进而影响根际微生物群落的种类与数量[2-3]。Bulgarelli等[4]总结了植物根系微生物区系的形成机理，认为植物可通过调整根面和内生菌的生长过程，形成植物所特有的根系核心微生物区系。并且，利用土壤微生物对根际分泌物的化学趋向响应，可诱导有益微生物在根际聚集，对防御病原微生物起到积极的作用[5-8]。

从根际分泌物的角度探讨植物连作障碍成因的研究表明，植物根际释放出的次生代谢产物中含有多种化学物质，不仅对植物具有直接的负面效应，还可诱导土壤中养分循环、微生物种群结构等生物或非生物因素改变[9-11]。根系分泌物介导的病原菌增加、土壤微生态失衡是导致后茬植物生长不良的主要原因，根系分泌物中化感物质是植物根际微生态灾变的重要诱因[12-13]。可见，植物根系释放的分泌物可被不同的微生物识别并产生不同的影响，尤其是在防御和诱导病原微生物方面存在显著差异，但由于土壤环境的复杂性以及目前对根系分泌物化学成分和关键活性物质认知的局限性，导致对上述差异形成原因的研究还存在很多空白，很多实质性问题未见报道。本研究基于课题组前期对人参主要土传病原菌生防菌的分离鉴定结果，以人参主要病害病原菌及其天敌生防菌为研究对象，分析人参根系分泌物中初生代谢产生的酸性物质（根系分泌物中长期存在，对人参具有显著自毒作用）与次生代谢合成的皂苷类物质（人参属根系分泌物中典型的物质）[14-16]对二者的影响，为探讨人参根系分泌物对病原菌、病原菌的天敌微生物的化感作用差异，研究人参根际分泌物对根际微生物群落变化的诱导效应奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

人参病原菌：以人参中常见的重大病害锈腐病、根腐病、黑斑病、菌核病的病原菌为受体。强壮土赤壳菌（Ilyonectria robusta，人参锈腐病病原菌）、腐皮镰孢菌（Fusarum solani，人参根腐病病原菌）、链格孢菌（Alternaria panax，人参黑斑病病原菌）、人参核盘菌（Sclerotinia ginseng，人参菌核病病原菌）由吉林农业大学植保实验室高洁老师惠赠。

人参生防菌：死谷芽孢杆菌（Bacillusvallismortis，SZ-4）、短波单胞菌（Brevundimonasterrae，SZ-22）、解 淀 粉 芽 孢 杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens，SZ-60）均由本实验室从人参根际土壤中分离得到，已证实对多种人参土传病害具有拮抗作用[14]，目前已被保存于国家菌种保藏中心。

供体物质：苯甲酸、邻苯二甲酸、丁二酸、己二酸，人参皂苷标准品Rb2(P15O10F94983)、Rd(Z13N8X48155)、Rc(M15O10S100110)、Rg1(G16S10Y9 7436)、Re(B04D9S76499)购自上海源叶生物科技有限公司（HPLC≥98%）。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基（PDA）、NA培养基（购于北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 供试含药培养基的配置

称取一定质量的酸类物质（苯甲酸、邻苯二甲酸、丁二酸、己二酸）、皂苷（Rb2、Rd、Rc、Rg1、Re）溶于甲醇中，配制成1 000.0、200.0、20.0、2.0、0.2 mg·L-1的母液。无菌条件下取100μL母液加入培养皿中，室温挥发干溶剂后将20 mL灭菌PDA培养基少量分次加入，搅拌溶解均匀后形成5.000、1.000、0.100、0.010、0.001 mg·L-1的含药培养基，用于病原菌培养，以不添加外源物质的培养基为CK，每个处理5次重复。最高含量梯度参考土壤中实际含量[17]并略有调整。

无菌条件下取250μL上述母液加入培养瓶中，室温挥发干溶剂后分次加入50 mL灭菌的NA培养液，搅拌均匀后形 成5.000、1.000、0.100、0.010、0.001 mg·L-1的含药培养基，用于生防菌培养，以不添加外源物质的培养基为CK，每个处理5次重复。

1.3 生物测定

1.3.1 病原菌作为受体 从生长状态良好的真菌菌落边缘取直径为5 mm的菌块接入培养基中央，放置在（25±2）℃恒温培养箱中进行培养。待对照组菌落直径达到培养基直径的70%～80%时结束培养，用十字测量法测量菌落直径，根据试验组与对照组的菌落直径计算化感物质的抑菌率。菌落抑制率计算公式如下。

式中，dc为对照组菌落直径，dt为试验组菌落直径。抑菌率正值代表抑制作用，负值代表促进作用。

1.3.2 生防菌作为受体 待培养液冷却后，用灭菌的移液器移取0.1 mL待测拮抗菌悬液，接种于含药NA培养液中振荡培养24 h（180 r·min-1，28℃）后，测定波长600 nm下的吸光值，检测拮抗菌生长状况。拮抗菌生长抑制率计算方法如下。

1.4 数据统计与分析

采用Excel对试验数据进行整理，DPS 9.50对试验数据进行差异显著性分析，Origin 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 酸性物质对人参病原菌及生防菌生长的影响

2.1.1 有机酸对人参病原菌的化感作用 由表1可见，强壮土赤壳菌（锈腐病病原菌）在有机酸处理下主要表现为生长受抑制，多数质量浓度处理与对照差异显著（P＜0.05），其中丁二酸、邻苯二甲 酸处理 分 别在0.010～1.000 mg·L-1、0.001～1.000 mg·L-1范围内表现出显著的抑制作用，作用强度7.96%～30.09%（P＜0.05），表明土壤中微量的该类物质即可对强壮土赤壳菌增长具有显著的抑制作用。对比4种有机酸平均抑制率可知，邻苯二甲酸对强壮土赤壳菌活性的抑制作用最大（14.11%），然后依次为己二酸（10.17%）、苯甲酸（6.65%）、丁二酸（4.57%）。

表1 有机酸对病原菌生长的影响Table 1 Influence of organic acids on the growth of pathogenic bacteria

分析有机酸对菌核病病原菌生长的影响可知，含有机酸的培养基刺激了人参核盘菌的生长，其菌落直径多大于对照，表明人参根际存在的有机酸类物质可促进核盘菌的增殖。其中苯甲酸在0.010～1.000 mg·L-1、丁二酸在0.001～1.000 mg·L-1范围内表现出对人参核盘菌活性的显著促进（促进作用7.8%～21.8%（P＜0.05））。对比4种有机酸的平均作用强度可知，丁二酸对该菌种活性促进作用最大（12.77%），其次依次为己二酸（9.25%）、苯甲酸（8.29%）、邻苯二甲酸（5.49%）。

分析有机酸对腐皮镰孢菌的影响可知，苯甲酸、丁二酸、己二酸对腐皮镰孢菌生长以促进为主（作用强度0.25%～9.41%）；邻苯二甲酸对其生长存在抑制作用（作用强度2.80%～7.12%）；多数处理未见与对照有显著差异。从人参链格孢菌测定结果可知，苯甲酸和丁二酸对其生长表现为低水平促进高水平抑制；己二酸与邻苯二甲酸与之相反，为低水平抑制高水平促进；大部分处理与对照未见有差异显著。上述分析表明腐皮镰孢菌、人参链格孢菌的生长受有机酸类物质影响较小。

2.1.2 有机酸对生防菌的化感作用 从图1可以看出，除邻苯二甲酸部分处理外，其余处理对死谷芽孢杆菌（SZ-4）的生长以促进为主，作用强度在3.26%～18.57%。苯甲酸处理在0.010～5.000 mg·L-1、丁 二 酸0.001～5.000 mg·L-1、己 二 酸0.010～1.000 mg·L-1对该生防菌生长具有显著的促进作用。

图1 有机酸对生防菌生长的影响Fig.1 Influence of organic acids on the growth of biocontrol bacteria

分析有机酸对短波单胞菌（SZ-22）生长的影响发现，除苯甲酸外，其余3种有机酸均对该菌生长有强烈的促进活性，作用强度8.28%～132.94%，作用水平范围介于0.001～5.000 mg·L-1，且大多数质量浓度处理与对照差异显著，表明SZ-22对土壤中丁二酸、己二酸和邻苯二甲酸敏感，这3种物质可在较大质量浓度范围内促进其生长。总体比较发现，己二酸促进作用最强（88.38%），其次依次为丁二酸（57.13%）、邻苯二甲酸（53.91%）。

分析4种有机酸对解淀粉芽孢杆菌（SZ-60）生长的影响可知，苯甲酸对其生长有促进作用；其余三者呈抑制作用，邻苯二甲酸抑制作用最强。邻苯二甲酸、苯甲酸各质量浓度梯度处理均与对照 差 异 显 著（P＜0.05），前 者 平 均 抑 制 强 度29.96%，后者平均促进强度46.91%。

2.2 人参皂苷对病原菌及生防菌生长的影响

2.2.1 人参皂苷对病原菌的化感作用 由表2可见，5种人参皂苷对强壮土赤壳菌的增长呈抑制作用，抑制强度6.64%～44.07%。其中，人参皂苷Re、Rc、Rd可分别在0.001 mg·L-1的5 000倍、1 000倍、100倍范围内对强壮土赤壳菌产生显著的抑制作用；人参皂苷Rb2、Rg1可分别在0.010 mg·L-1的500倍、0.100 mg·L-1的50倍范围内产生类似作用。

表2 人参皂苷对病原菌生长的影响Table 2 Influence of saponins on the growth of pathogenic bacteria

5种皂苷对人参核盘菌生长的影响以促进为主，作用强度1.32%～22.85%，影响最大的是Rg1，然后依次是Rc、Rd、Re、Rb2。其中，Rg1作用范围为0.001 mg·L-1的5 000倍，其余皂苷作用质量浓度范围较窄（5～50倍）。分析皂苷对腐皮镰孢菌和人参链格孢菌生长的影响可见，皂苷对二者的生长以促进为主，促进作用分别为0.51%～8.91%、0.54%～9.83%，多数处理与对照无显著差异，表明5种皂苷对腐皮镰孢菌和人参链格孢菌生长影响较小。

2.2.2 人参皂苷对生防菌的化感作用 由图2可见，除Rb2外其余4种皂苷可促进SZ-4的生长，其中Rc活性最强（平均强度15.92%），其次依次为Rd（6.52%）、Rg1（5.76%）、Re（4.87%）。5种皂苷中Rc、Re产生显著影响的水平范围分别为0.001 mg·L-1的5 000倍、100倍内，其余皂苷处理作用范围较窄。5种皂苷对SZ-22的生长以促进为主，作用强度0.27%～11.29%，影响最大的是Rd、Rb2、Re，其中Rd显著作用范围为0.001 mg·L-1的100倍内，其余皂苷的显著作用梯度分散。分析皂苷对SZ-60生长的影响可见，Rb2所有处理水平下SZ-60生长受抑，平均抑制率10.77%；Rc所有处理水平下SZ-60生长受激，平均促进强度15.74%；Rd、Re、Rg1对SZ-60生长均表现为低质量浓度促进高质量浓度抑制，其促进活性Rd（82.75%）＞Re（79.06%）＞Rg1（7.97%），抑制活性Re（28.91%）＞Rg1（20.89%）＞Rd（7.11%）。

图2 皂苷对生防菌生长的影响Fig.2 Influence of saponins on the growth of biocontrol bacteria

2.3 两类物质对土壤微生物化感作用的综合分析

根据上述分析，将与对照具有显著差异的处理及梯度汇总，结果如图3所示。由于溶液较稀，1 mg·L-1溶液密度与水相似，故1 mg·L-1约等于1 ppm，据此将上述质量浓度处理转换为ppm，以便表示微生物对物质的敏感程度。由图3可见，每种物质可显著影响4～5种土壤微生物，对强壮土赤壳菌以抑制为主，对人参核盘菌、SZ-4、SZ-22以促进为主；溶液水平为ppb级的己二酸、邻苯二甲酸、Rd、Re可分别显著影响5、4、4、4种受体生长，其余物质可影响1～3种，己二酸、邻苯二甲酸、Rd、Re可在ppb～ppm（1 000倍）范围对3～5种受体产生显著影响，苯甲酸、丁二酸、Rb2、Rc、Rg1主要集中在10-2ppm～ppm（100倍）范围内对受体产生显著影响；ppb质量浓度的苯甲酸、Rc、Rd、Re具有抑制病原菌、促进生防菌的作用；在所有与对照差异显著的处理中，70%以上处理作用强度低于20%，作用强度大于40%的处理仅占17%。

图3 有机酸、皂苷对微生物影响的对比分析Fig.3 Comparative analysis of the effects of organic acids and saponins on microorganisms

2.4 两类物质对土壤微生物化感作用的统计分析

2.4.1 菌种间比较分析 采用非参数Kruskal-Wallis检验对病原菌和生防菌间差异进行分析（图4）发现，病原真菌组秩（113.44）＞生防细菌组秩（112.70），P=0.933，表明有机酸与皂苷类物质对病原菌影响略大于生防菌，但二者间无显著差异。菌种间分析结果由图4可见，SZ-60秩＞强壮土赤壳菌秩＞人参核盘菌秩＞SZ-22秩＞SZ-4秩，SZ-60秩与后三者差异显著，表明有机酸与皂苷类物质对SZ-60生长影响最大。

2.4.2 物质间比较分析 采用非参数Kruskal-Wall is检验对有机酸与皂苷间差异进行分析（图4）发现，有机酸组秩（120.22）＞皂苷组秩（109.39），P=0.239，表明有机酸对微生物影响略大于皂苷，但二者间无显著差异。

对物质间进行差异分析显示，9种物质对强壮土赤壳菌、人参核盘菌生长的影响差异不显著（P=0.434、0.187），对生防菌的生长，物质间影响差异显著，其成对比较结果如图4。可以看出，对SZ-4、SZ-22、SZ-60生长影响最大的物质分别是Rc、己二酸、Rd，三者均与最小秩组差异显著，与其他组差异不显著。

图4 Kruskal-Wallis检验成对比较结果Fig.4 Pairwise comparison results of Kruskal-Wallis test

3 讨论

近年来，研究者在不同植物根际分泌物中分离、鉴定了多种化感物质，包括酸类、萜类、黄酮类化合物等[18-19]。不同植物根系分泌物的组成及数量之间存在较大差异。如木麻黄根际土壤中检测到香草酸、阿魏酸、没食子酸、对香豆酸和水杨酸5种酚酸类物质，其含量介于24.86～412.56 mg·kg-1[20]；地黄根际土壤中可检测到香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸等酸性物质，其含量介于1.020～398.812 mg·kg-1[21]。本课题组前期研究也发现酸性化合物是人参根系分泌物中的重要组成部分，其占比约为13.52%，主要成分为苯甲酸、邻苯二甲酸酯、丁二酸等物质[22]。除酸性化合物外，萜类化合物也广泛存在于人参、三七、地黄、太子参、半夏等药用植物根系分泌物中[23-24]。有关萜类物质生理生态功能的研究发现，很多萜类物质具有活跃的化感活性，可通过影响植物的呼吸作用、改变营养循环速率而对植物的生长产生不利影响[25-26]；在三七、人参等植物的连作障碍中，皂苷还被视为一种主要的引诱剂，对微生物种群具有调控作用[27-28]。目前人参属植物中已分离鉴定出Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rg1、Rg2等10余种皂苷[23-24]。有关2类物质对植物的化感活性已有较多的报道，如香豆酸的含量可以显著中断大豆根的伸长[29]；邻苯二甲酸、硬脂酸、棕榈酸和苯甲酸对三七种子的萌发及幼苗的生长具有毒害作用[30]；丁二酸、己二酸等酸性物质对人参愈伤组织具有显著的化感活性[22]等。但这些物质对植物根际微生物，尤其是致病微生物及其生防微生物之间化感作用的差异还缺乏更多深入的研究。本研究分析了有机酸及皂苷类物质对根际微生物生长的影响，结果发现上述物质对土壤微生物的化感作用与对植物的化感作用存在相似之处，即化感作用类型可分为不敏感（腐皮镰孢菌、人参链孢菌）、抑制作用（强壮土赤壳菌）、促进作用（人参核盘菌、SZ-4、SZ-22）。2类物质对微生物的化感作用强度介于-132.94%～31.33%，总体表现为促进作用大于抑制作用，处理水平间存在随着供试物质质量浓度增加促进活性减弱或转为抑制作用的变化趋势，但未见明显的水平效应，这与以植物受体的研究结果存在较大差异[31]。

其次，比较酸性物质与皂苷二者间化感活性差异发现，有机酸与皂苷均可显著影响4～5种土壤微生物，二者均可在极低的水平条件下（ppb～ppm级）对受体产生显著影响，符合化感物质微量（微克到皮克级）、高效的特点[32]，证明二者均是影响人参根际微生态的重要化感物质。Kruskal-Wallis检验显示，有机酸对微生物影响略大于皂苷，但二者间无显著差异，这可能与试验水平设置有关。考虑到植物根系代谢物分泌是动态、微量的，土壤微生物对其存在转化和降解以及实验室提取技术的富集作用，故本试验设置水平均低于土壤中实测的动态水平，这可能是导致二者之间差异不显著的主要原因。此外人参根际7种微生物生长可受到酚酸与皂苷类物质的共同影响，其效果可能与中药的“活性物质群”类似[11]，有研究称这类物质为“化感功能物质团”[38]。本研究中己二酸、邻苯二甲酸、人参皂苷Rd、人参皂苷Re可对半数以上受体产生显著影响，阈值低（ppb）、作用浓度广（ppb～ppm），提示其可能是人参根系分泌物中主要的活性物质，其中ppb水平的Rd、Re具有抑制病原菌、促进生防菌的作用，表现出显著的防御功能。

研究认为连作障碍植物根际土传病害流行与某些根系分泌物对病原菌或生防菌具有偏利/偏害的作用有关，从而引起土壤微生物群落失衡[33-34]。本研究中发现有机酸及皂苷可抑制强壮土赤壳菌的生长，促进人参核盘菌、人参链格孢菌、腐皮镰孢菌、SZ-4、SZ-22增殖，对生防菌的促进作用大于病原菌，表现出对生防菌的偏利作用。其次，邻苯二甲酸对人参核盘菌和强壮土赤壳菌分别表现出促进与抑制作用，对生防菌SZ-4和SZ-60分别表现出促进与抑制作用，类似的现象还存在于己二酸、人参皂苷Rb2等物质处理中，说明化感物质对病原菌或生防菌组内菌种也存在偏利/偏害作用。推测当根系分泌物与复杂的微生物体系接触时，具体表现为对微生物群落的正面或负面调节，可能还需要综合考虑物质与菌种的识别速度、土壤溶液中有效含量等因素[12]。由于本试验仅对供体与受体之间进行了一对一的研究，有关一对多、多对多以及复杂的土壤环境中人参根系分泌物对微生物群落的影响差异还需要更多的试验加以说明。