衢枳壳及其近缘种中四种黄酮苷类成分含量测定与相关性分析

叶雨濛 胡诗雨 徐象华 颜福花 秦路平 朱 波

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实，其中衢枳壳为芸香科植物胡柚Citrus maxima（Burm）Merr.的干燥未成熟果实，是浙江省道地药材，新“浙八味”之一，性微寒，味苦、辛、酸，入肺、脾、大肠经，具有理气宽中、行滞消胀之功效，主治胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症[1]。现代化学与药理学研究表明，枳壳中含有黄酮[2]、挥发油[3]和生物碱[4]等化学成分，具有抑菌[5]、降血脂[6]、抗抑郁[7]等药理活性。目前，枳壳研究多集中在栽培技术、采收时间、干燥加工技术、炮制方法、药理活性等方面[8-11]。而对衢枳壳及其近缘种中黄酮苷类成分含量测定的研究较少，本研究收集衢枳壳、成熟胡柚及其近缘种瓯柑的种质资源，建立高效液相色湘（HPLC）法测定上述样品中四种黄酮苷类成分的含量，并分析其与经纬度、海拔之间的相关性，以期为衢枳壳质量评价及枳壳替代品的资源开发利用提供参考依据。

1 材 料

1.1 药 材 分别收集丽水老竹、丽水碧湖、衢州球川和衢州天马四个产地的有籽瓯柑、无籽瓯柑、衢枳壳和胡柚。见表1。

表1 衢枳壳及其近缘种样品信息

1.2 仪器与试剂 600-2998 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；FA2004 型电子分析天平（上海恒平精密电子仪器有限公司）；JP-180ST 型超声波清洗机（深圳市结盟清洗设备有限公司）；XL-02A 型手提式粉碎机（杭州旭众机械设备有限公司）；新橙皮苷（Y28F11Y16982）、橙皮苷（K09S11L123847）、柚皮苷（H24N9Z75896）、芸香柚皮苷（P26J12L138815）对照品购于上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯（北京京科瑞达科技有限公司）；甲醇、磷酸等试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方 法

2.1 色谱条件 Waters Xbridge C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1%磷酸水；体积流量1 mL/min；检测波长283 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别称取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4 个对照品适量，精密称定，置于不同10 mL 容量瓶中，加甲醇使之溶解并制成质量浓度均为0.1 mg/mL 的对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液 分别取衢枳壳、胡柚、有籽瓯柑、无籽瓯柑样品，粉碎，过3 号筛。取约2.0 g 样品粉末，精密称定，置于100 mL 圆底烧瓶中，加入50 mL 80%甲醇，固定于冷凝管上。70 ℃加热回流1.5 h，抽滤，浓缩，用80%甲醇定容至100 mL 容量瓶，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察 分别将“2.2.1”项下制备的四种对照品溶液用移液管精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mL 至不同10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成系列质量浓度对照品溶液，微孔滤膜过滤后取滤液，在“2.1”项条件下进样，记录色谱图。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，见表2。

表2 线性关系考察

2.4 稳定性试验 随机取1 供试品溶液，在“2.1”项条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，记录各成分保留时间和峰面积，计算该样品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷峰面积RSD，测定该供试品溶液在24 h 内的稳定性。

2.5 精密度试验 配制新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷的混标溶液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，在“2.1”项条件下连续进样6 次，记录各成分保留时间和峰面积，计算对照品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷峰面积RSD，测定仪器的精密度。

2.6 重复性试验 随机取1 样品粉末6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再在“2.1”项条件下进样，记录各成分保留时间和峰面积，按外标法计算各成分含量并计算RSD，测定该方法的重复性。

2.7 加样回收试验 取已知含量的有籽瓯柑样品，精密称取0.1 g，加入芸香柚皮苷对照品0.2 mg，柚皮苷对照品0.3 mg，橙皮苷对照品0.5 mg；另精密称取0.01 g 该样品粉末，加入2 mg 新橙皮苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再在“2.1”项条件下进样，平行6 次，记录峰面积，以外标法计算各成分的含量并计算加样回收率。

2.8 样品含量测定 取衢枳壳、胡柚、有籽瓯柑、无籽瓯柑样品粉末各约2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再在“1.3.1”项条件下进样，平行3 次，记录峰面积并按外标法计算各成分含量，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.9 统计学方法 应用SPSS 与EXCEL 2010 软件统计数据，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用ANOVA 单因素方差分析，两两比较采用图基检验法（Tukey 法），以P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 HPLC 方法建立 稳定性实验测得有籽瓯柑样品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷峰面积RSD 分别为0.6961%、0.0982%、0.1393%、0.4997%，表明样品溶液在24 h 内稳定性良好；精密度实验测得对照品新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷峰面积RSD 分别为0.228%、0.353%、0.033%、0.110%，表明仪器精密度良好；重复性实验测得有籽瓯柑样品中新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷平均含量分别为249.2373 mg/g、4.7654 mg/g、3.1225 mg/g、1.9203 mg/g，RSD 分别为0.417%、0.606%、0.851%、0.307%，表明该方法重复性良好。

加样回收实验测得新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷的平均加样回收率分别为99.51%、98.15%、100.35%、100.63%，RSD 分 别 为 1.22%、1.60%、2.09%、1.87%（见表3）。结果显示，衢枳壳、成熟胡柚及其近缘种瓯柑中的四种黄酮苷类成分在以80%甲醇为提取溶剂，70 ℃加热回流1.5 h 的条件下可提取完全。在“Waters Xbridge C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.1%磷酸水，体积流量1 mL/min，检测波长283 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL”的色谱条件下，出峰时间早，各色谱峰分离度好。

表3 加样回收率试验结果（n=6）

3.2 含量比较 衢枳壳、胡柚中橙皮苷的平均含量最低，分别为3.6461、2.7922 mg/g；有籽瓯柑、无籽瓯柑中芸香柚皮苷的平均含量最低，分别为1.8617、1.9154 mg/g。从新橙皮苷的含量来看，有籽瓯柑、无籽瓯柑中的新橙皮苷含量显著高于衢枳壳和胡柚，其中无籽瓯柑的新橙皮苷含量最高，达291.0858 mg/g，分别是衢枳壳和胡柚的3.14、2.98 倍；衢枳壳、胡柚中的柚皮苷含量显著大于有籽瓯柑、无籽瓯柑，其中衢枳壳中的柚皮苷含量分别是有籽瓯柑、无籽瓯柑的7.82、7.08 倍。

从芸香柚皮苷、柚皮苷的含量来看，衢枳壳与胡柚、有籽瓯柑、无籽瓯柑之间差异有统计学意义（P<0.05），胡柚与有籽瓯柑、无籽瓯柑之间差异有统计学意义（P<0.05），而有籽瓯柑与无籽瓯柑之间差异无统计学意义（P>0.05）；从橙皮苷、新橙皮苷的含量来看，衢枳壳、胡柚和有籽瓯柑、无籽瓯柑之间差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

表4 衢枳壳及其近缘种中四种黄酮苷含量比较（n=3）

3.3 相关性分析 相关性分析显示，芸香柚皮苷含量与纬度、海拔呈显著正相关关系，其中与海拔的正相关系数最大，为0.9956，与经度呈显著负相关关系；柚皮苷含量与纬度、海拔呈显著正相关关系，与经度呈显著负相关关系，其负相关系数达-0.9964；橙皮苷、新橙皮苷含量与纬度、海拔呈显著负相关关系，与经度呈显著正相关关系，见表5。

表5 四种黄酮苷含量与产地生境因子相关性分析

4 讨论

黄酮苷类成分是中药枳壳发挥理气宽中、行滞消胀等药理作用的重要活性成分，也是评价衢枳壳质量的重要指标性成分[12-13]。建立HPLC 法测定衢枳壳及其近缘种中黄酮苷类成分含量，对中药衢枳壳的质量控制及其近缘种中药资源开发具有重要意义。同时，本试验还考察了不同提取方法（索式提取、加热回流提取、超声提取），加热时间（30、60、90 min），提取温度（60、70、80 ℃），流动相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.5%磷酸水）对衢枳壳、成熟胡柚及瓯柑中四种黄酮苷类成分含量测定的影响，发现以80%甲醇为提取剂，70 ℃下加热回流提取1.5 h，即可提取完全，该方法可用于衢枳壳药材质量控制及其近缘种中黄酮苷类成分的含量测定。

柚皮苷与新橙皮苷是2020 年版《中国药典》中枳壳的含量测定指标性成分[1]。试验结果显示，成熟胡柚新橙皮苷含量高于衢枳壳，但柚皮苷、芸香柚皮苷、橙皮苷含量均低于衢枳壳，从含量测定角度看，我们认为成熟胡柚不适合作为衢枳壳的替代品。试验从化学成分的角度论证了枳壳的采收时期应以未成熟果实为佳。此外，虽然有籽瓯柑与无籽瓯柑中柚皮苷含量低于衢枳壳，但新橙皮苷含量是衢枳壳的2.80～3.14 倍，有望进一步通过药效学评价，将瓯柑的外果皮作为衢枳壳的中药替代资源。

药用植物生长发育与次生代谢受多种环境因素影响，包括海拔、经纬度、光照等。本试验结果表明，产地、经纬度、海拔显著影响衢枳壳及其近缘种中黄酮苷类成分含量的积累。从柚皮苷的含量来看，衢枳壳及其近缘种种植于低经度、高纬度、高海拔的地区，可能有利于提高衢枳壳及其近缘种中的柚皮苷含量，为衢枳壳的种植研究提供依据，但是，低经度、高纬度、高海拔的地区并不利于新橙皮苷含量的积累。因此，在实际生产中，应综合种质、产地、经纬度与海拔等多因素考虑，选择适宜的衢枳壳种植区域。下一步，我们将针对同一区域不同海拔栽培的衢枳壳进行资源收集与黄酮苷类成分含量测定，以期为衢枳壳的人工栽培提供更多的参考依据。[本文受浙江省丽水市科技计划项目（浙大合作项目）2018zdhz11 支持]