松香酸通过上调miR-30a-3p 表达增强缺氧诱导的HUVECs 血管生成

吴德虎 唐慧莉 陈 慧

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的主要病理原因是冠状动脉闭塞后的心肌缺血和缺氧[1]。对于不能及时接受再灌注治疗或再灌注治疗后仍会出现心肌缺血的患者，增强血管新生可能是另一种治疗途径[2]。血管生成是血管发展和生长新的毛细血管的过程[3]，其在生理条件下受到严格调控[4]。研究表明，miR-30a-3p 在血管生成、内皮细胞功能中具有重要意义[5-6]。松香酸（abietic acid）是一种松香烷二萜类化合物，有抗过敏、抗炎、抗惊厥等作用[7]。研究显示，松香酸可以增强人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）迁移及小管形成。然而，松香酸对AMI 后内皮血管生成及其具体的作用机制尚未得到明确研究。因此本研究通过体外实验，以HUVECs 细胞缺氧模型为研究对象，探讨松香酸对AMI 后内皮细胞血管生成及迁移的作用，为开发新的AMI 治疗靶标提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试 剂 胎牛血清（Gibico，USA，10270-106），DMEM 培养基（Gibico，USA，11965092），松香酸（Sigma-Aldrich，USA，514-10-3），兔抗血管内皮生长因子A（VEGFA）单克隆抗体（Cell Signaling Technology，USA，65373S），兔抗GAPDH 单克隆抗体（Cell Signaling Technology，USA，2118S），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（Beyotime，China，A0208），TRIzol RNA 分离试剂（Invitrogen，USA，15596026），M-MLV Reverse Transcriptase 试剂盒（Solarbio，China，RP1100），TaqMan primers and probes（Applied Biosystems，USA，000416）。

1.2 细胞培养及处理 将HUVECs 培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素的DMEM 培养基中，于37 ℃，含5%CO2温箱中培养。之后进行缺氧处理，将细胞转移至含1%O2、5%CO2和94% N2的37 ℃温箱中培养。

1.3 实验分组及处理 将培养好的细胞分为常氧组（正常供氧）、缺氧组（限制氧气供给，缺氧处理）。之后在缺氧的基础上，分别使用0.5、1、2 μmol/L 的松香酸处理细胞，即：缺氧+0.5、2 μmol/L 松香酸组。

为进一步明确松香酸是否通过miR-30a-3p 发挥作用，将缺氧诱导的细胞分为：缺氧组缺氧+2 μmol/L 松香酸组，缺氧+2 μmol/L 松香酸+miR-30a-3p inhibitor 组，缺氧+2 μmol/L 松香酸+非特异性对照（NC）组。miR-30a-3p inhibitor 及NC 购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。

1.4 Matrigel 小管形成测定 使用48 孔板进行实验，首先在每孔中加入150～200 μL Matrigel，均匀覆盖孔板底部，放置在37 ℃温箱中，直至Matrigel 固化。之后每组取2×104个细胞分别接种至孔板中，4～6 h 后观察血管生成的变化。

1.5 Transwell 测定细胞迁移 将各组细胞按照1.3所述进行处理，培养至密度为95%，含2%血清的完全培养基维持24 h。消化收集细胞。将100 μL 细胞悬液加至上室，下室加500 μL 完全培养基。37 ℃含5% CO2温箱中培养24 h。弃去培养基，胎牛血清轻柔洗去未迁移细胞，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色，显微镜下观察。

1.6 伤口愈合实验测定细胞迁移 使用6 孔板进行实验，各组细胞处理方式同1.3。各组分别取3×105个细胞接种于6 孔板中，置于培养箱内，细胞培养至单层后，使用100 μL 无菌枪头制造划痕。使用胎牛血清轻柔洗涤，清除划痕区域残留细胞，将细胞置于37℃温箱中继续培养，之后于显微镜下观察。

1.7 Western blot 收集各处理组细胞，提取总蛋白，检测蛋白浓度，适当稀释后加样至SDS-PAGE胶，电泳转膜。5%脱脂奶粉封闭，洗膜3 次。加稀释好的一抗（VEGFA，1∶1000）孵育过夜，洗膜3 次。加入二抗，ECL 显影曝光。

1.8 qRT-PCR 收集各组细胞，使用TRIzol RNA分离试剂提取总RNA，使用M-MLV Reverse Transcriptase 试剂盒获取cDNA，使用TaqMan 检测miR-30a-3p 的转录水平，2-ΔΔCt法分析miR-30a-3p 的相对表达量。miR-30a-3p 引物序列如下：F：5'-GCGCTTTCAGTCGGATGTT-3'，R：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'。委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.9 统计学方法 应用GraphPad Prism 8.0.1 对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用Unpaired t 检验；计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧抑制HUVECs 的血管生成和迁移 为了验证松香酸对AMI 血管生成的影响，首先通过体外诱导HUVECs 细胞缺氧模型。分别通过小管形成测定、Transwell 和伤口愈合实验来评估细胞的血管生成和迁移，结果显示，缺氧处理显著抑制HUVECs 的血管生成和迁移能力。见图1。

图1 缺氧抑制HUVECs 的血管生成和迁移

2.2 松香酸促进缺氧诱导的HUVECs 的血管生成检测松香酸对缺氧诱导的HUVECs 血管生成的影响。结果显示，与单纯缺氧诱导比较，松香酸能够以剂量依赖性方式促进细胞的血管生成，且随着松香酸浓度的升高，细胞的血管生成更加明显，VFGFA的表达水平也随之升高，以2 μmol/L 效果最为显著（见图2A）。此外，Western blot 结果显示，松香酸能够显著增加HUVECs 中血管生成因子VEGFA 的表达水平，且在2 μmol/L 的松香酸作用下，VEGFA 的表达量最高。见图2B。

图2 松香酸促进缺氧诱导的HUVECs 的血管生成

2.3 松香酸促进缺氧诱导的HUVECs 的迁移Transwell 迁移测定结果显示，与单纯缺氧诱导比较，松香酸处理会显著增加细胞迁移见（图3A）。同时，伤口愈合实验还表明，松香酸显著刺激HUVECs 的伤口愈合能力（图3B）。松香酸促进缺氧诱导的HUVECs 的迁移，随着松香酸作用浓度的升高，对细胞迁移、伤口愈合的作用愈加明显，松香酸作用浓度为2 μmol/L 时，效果最佳。因此选择浓度为2 μmol/L 的松香酸进行后续实验。

图3 松香酸促进缺氧诱导的HUVECs 的迁移

2.4 松香酸上调缺氧诱导的HUVECs miR-30a-3p表达 通过qRT-PCR，我们发现松香酸处理后，miR-30a-3p 表达明显上调（见图4A）。为进一步研究松香酸是否通过miR-30a-3p 对缺氧诱导的HUVECs 的血管生成和迁移发挥作用，首先合成miR-30a-3p inhibitor 来抑制细胞miR-30a-3p 表达水平，见图4B。

图4 松香酸上调缺氧诱导的HUVECs miR-30a-3p 表达

2.5 松香酸通过上调miR-30a-3p 表达促进缺氧诱导的HUVECs 的血管生成和迁移 为了进一步验证松香酸是否通过miR-30a-3p 促进缺氧诱导的HUVECs 的血管生成、迁移和伤口愈合，在松香酸处理的基础上在细胞中抑制miR-30a-3p。结果显示，抑制miR-30a-3p 后，由松香酸促进的血管生成被逆转、血管生成因子VEGFA 水平下降。此外，松香酸促进缺氧诱导的HUVECs 的迁移，能够被miR-30a-3p inhibitor抑制。而NC 组与松香酸组相比则无明显变化。见图5。

图5 松香酸通过miR-30a-3p 促进缺氧诱导的HUVECs 的血管生成和迁移

3 讨论

AMI 的主要特征是动脉粥样斑块破裂和急性动脉闭塞，残留血管的再循环和快速血管生成是心肌梗死后心脏修复的关键[8]。血管生成与创伤愈合、肉芽组织形成和胚胎发生等各种生理和病理过程有关，其能够通过促进新毛细血管的生成，恢复缺血组织的血液流动，进而促进心肌再生[9]。因此，可以通过促进血管生成治疗心血管疾病。血管内皮细胞是一种单层，形状不规则呈多边形的细胞，覆盖于内膜表面，位于血管与血管内皮之间，且具有通透性、选择性、凝血、纤溶和血液运输能力，参与血管活性物质的代谢和调控，产生生长因子和纤维增生，影响血管的生成[10]。同时心肌缺氧也是导致AMI 的主要原因之一，因此本研究以HUVECs 为研究对象，通过构建细胞缺氧模型来模拟体外AMI。内皮细胞的增殖和迁移是血管生成的两个重要环节，因此缺氧诱导后，通过Matrigel 小管形成实验、Transwell 及伤口愈合实验检测了HUVECs 的血管生成和迁移功能变化，结果显示该功能被抑制。

松香酸具有抗炎症、抗过敏、类植物抗毒素和抗惊厥的活性，Park 等[11]研究发现，松香酸能够通过激活ERK 和p38 MAPKs 来促进HUVECs 细胞迁移和血管形成。因此，松香酸或许能够通过影响血管生成，从而调节心血管功能，但目前在此方面研究较少。本研究实验结果发现，松香酸可以促进缺氧诱导的HUVECs 的血管生成和迁移，并上调血管生成因子VEGFA 的表达。

miRNA 是一类与靶mRNA 结合的非编码小RNA，导致靶蛋白的抑制，同时也在内皮细胞和血管生成的许多功能中发挥重要作用[12]，进而对机体的某些功能产生影响。已有研究证明，心血管疾病可引起机体内特定miRNA 表达水平的变化，因此某些特异性的miRNA 可能在心血管疾病的诊断和预防中发挥关键作用。miR-30a-3p 是进化保守的miR-30a 家族的成员之一，已被证实是多种细胞类型中重要的调节因子，具有抗增殖、促凋亡和抗炎活性[13]。Volkmann 等[6]的研究结果显示，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通过下调miR-30a-3p 损伤内皮血管生成。本研究发现，松香酸可以促进缺氧诱导的HUVECs 中miR-30a-3p 的表达。为进一步明确松香酸是否通过miR-30a-3p 调节HUVECs 的血管生成和组织迁移，将miR-30a-3p 抑制剂miR-30a-3p inhibitor 及其对照miRNA NC 转染至细胞内，检测血管生成及组织迁移的变化，结果发现miR-30a-3p 被抑制后，松香酸促进HUVECs 的血管生成和迁移的作用被削弱，根据结果可以推测，松香酸可能通过上调miR-30a-3p 表达促进缺氧情况下HUVECs 的血管生成和迁移能力。