基于网络药理学探讨补中益气汤治疗糖尿病胃轻瘫的作用机制

于文彦 吴攀峰 芮 君 张 弘

糖尿病胃轻瘫（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常见慢性并发症之一，以排除消化道机械性梗阻情况下出现的胃排空延迟为主要特点，主要临床症状包括早期饱腹、腹胀腹痛、恶心呕吐、体质量减轻等，严重影响食物、药物的消化吸收，加重血糖调节受损和营养不良，进而严重影响患者生活质量[1]。目前DGP 尚缺乏安全有效的治疗手段。促胃肠动力药物、胃电刺激、经口内镜下幽门肌切开术（GPOEM）等治疗手段，存在部分患者无法耐受的不良反应和一定的治疗失效率[2-3]。研究显示，中医药可显著减轻DGP 患者胃肠道症状，且不良反应少，复发率低[4]。补中益气汤是DGP 常用中药方剂之一，由黄芪、白术、陈皮、升麻、柴胡、人参、甘草、当归等药物组成。研究显示，补中益气汤治疗DGP 临床疗效良好[5-6]。但目前相关研究仍相对较少，其作用机制尚未明确。本研究拟通过网络药理学方法，探讨补中益气汤治疗DGP 的作用机制，为后续进一步实验提供研究方向和理论依据。

1 资料与方法

1.1 补中益气汤活性成分及靶点筛选 BATMANTCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）平台是一个基于“多成分-多靶点-多通路”的网络药理学思路，以“药物-靶点相似性”模型筛选靶点，系统揭示中药复方化学成分作用靶点及机制的在线分析工具[7]。本研究将补中益气汤组方中的“黄芪、白术、陈皮、升麻、柴胡、人参、甘草、当归”完整拼音输入BATMANTCM 平台作为整体对象，以P＜0.05 和Score cutoff＞20 为切点，对补中益气汤的活性成分和相关靶点进行筛选。

1.2 DGP 相关基因的获取 本研究应用GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/）、GenCLiP 3 数据库（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）、GeneCards 数 据库（https://www.genecards.org/）及TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/），以“diabetic gastroparesis（糖尿病胃轻瘫）”为关键词，获取DGP 相关基因。

1.3 补中益气汤治疗DGP 的潜在靶点获取 将1.1中筛选得到的补中益气汤作用靶点与1.2 中获取的DGP 相关基因取交集，得到补中益气汤治疗DGP 的潜在作用靶点，并利用Cytoscape3.7.1 软件构建补中益气汤活性成分-DGP 靶点网络图。

1.4 交集靶点蛋白相互作用网络构建 将1.3 中得到的交集靶点导入STRING 数据库（https://string-db.org/），设定物种为“homo sapiens（人类）”，设定最低相互作用评分置信度为0.70，获得交集靶点所编码蛋白的相互作用结果。将该结果导入Cytoscape3.7.1软件进行可视化，构建补中益气汤和DGP 的交集蛋白互作网络图。通过CytoNCA 插件计算网络图中各节点的度中心度、中介中心度和接近中心度，以进一步衡量网络中各蛋白的关联性和重要性。

1.5 交集靶点基因功能分类及通路富集分析 利用Cytoscape3.7.1 软件中的ClueGO 插件对交集靶点基因的细胞功能、分子功能和生物功能进行基因分类（gene ontology，GO）富集分析及可视化。使用Cytoscape3.7.1 软件中的CluePedia 插件对靶点基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析及可视化。设定P 值＜0.05 为统计阈值，得到补中益气汤治疗GDP 的潜在作用通路。

2 结果

2.1 补中益气汤主要活性成分及靶点 在BATMANTCM 平台收集补中益气汤的活性成分，以P＜0.05 和Score cutoff＞20 作为筛选切点，去除重复后，得到236 种补中益气汤活性化学成分，及各活性成分对应的靶点，共计1674 个。

2.2 DGP 相关基因及药物-疾病靶点网络 为全面充分地收集DGP 相关基因，本研究通过多个数据库（GEO、DisGeNET、GenCLiP 3、GeneCards、TTD）进行收集，获取DGP 相关基因582 个。将其与补中益气汤活性成分对应的靶点取交集后，得到130 个补中益气汤治疗DGP 的潜在靶点，对应185 个活性成分。利用Cytoscape3.7.1 软件构建补中益气汤活性成分-DGP 靶点网络（见图1）。该网络中共有315 个节点，其中药物活性成分节点185 个，疾病靶点节点130 个，成分与靶点间存在1256 条相互作用连线。根据图1，活性成分三磷酸腺苷（adenosine triphosphate）对应的靶点最多，为26 个，其次为呋喃色酮（Visnagin），对应25 个靶点，十七醇（1-heptadecanol），对应21 个靶点，香芹酚（carvacrol），对应19个靶点。进一步分析发现，79.23%的靶点与2 个以上活性成分相互作用，69.19%的活性成分调控2 个以上靶点，充分体现了中药“多成分-多靶点”的整体调节作用。

2.3 补中益气汤和DGP 交集靶点蛋白互作网络将130 个药物-疾病交集基因导入STRING 数据库进行蛋白互作网络分析，结果导入Cytoscape3.7.1 软件进行可视化，构建补中益气汤和DGP 的交集靶点蛋白互作网络图（见图2）。图中节点表示蛋白，连线表示蛋白之间的关联。节点的大小和颜色表示度中心度值的大小。节点越大，颜色越深，度中心度值越大，表示该节点在网络中越重要。连线的粗细表示合并分值的高低，连线越粗，分值越高，表示节点间的关联度越强。网络中发生相互作用的节点有128 个，共有1198 条连线，各节点的平均度中心度值为18.71，平均中介中心度值为0.010，平均接近中心度值为0.45。各连线的平均合并分值为0.67。度中心度值、中介中心度值、度接近中心度值均超过平均值的关键靶点共有10 个（见表1）。

表1 补中益气汤治疗糖尿病胃轻瘫的关键靶点信息

图2 补中益气汤和糖尿病胃轻瘫交集靶点蛋白互作网络

2.4 药物-疾病交集靶点基因GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用Cytoscape 软件中的ClueGO 插件对药物-疾病交集靶点基因进行GO 功能富集分析及可视化。设定P＜0.05 为差异有统计学意义，共获得32 个GO 功能富集。用饼状图描述参与不同生物学功能的靶点基因占总交集靶点基因的数量百分比（见图3）。结果显示，补中益气汤可能通过调节神经递质受体活性（24.44%）、G 蛋白偶联受体活性（7.41%）、脂肪酶活性（6.67%）、细胞凋亡过程中半胱氨酸型内肽酶活性（6.30%）、氧化还原酶活性（5.93%）、电压门控钾通道活性（5.56%）、AMP 活化蛋白激酶活性（3.70%）、肾上腺素能受体活性（3.33%）、细胞因子活性（2.96%）等多途径治疗DGP。

图3 药物-疾病交集靶点基因功能富集分析

使用Cytoscape3.7.1 软件中的CluePedia 插件对靶点基因进行KEGG 通路富集分析及可视化。设定P 值＜0.05 为统计阈值，共得到24 条KEGG 通路。用饼状图描述参与不同信号通路的靶点基因占总交集靶点基因的数量百分比（见图4）。结果显示，补中益气汤可能通过调节催产素信号通路（42.80%）、AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）信号通路（13.98%）、胰岛素抵抗（5.08%）、磷脂酰肌醇激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号通路（5.08%）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路（4.66%）、肾素-血管紧张素系统（Ras）信号通路（2.97%）、环磷酸鸟苷酸-蛋白激酶G（cGMP-PKG）信号通路（1.69%）、血管平滑肌收缩（1.69%）等多条信号通路治疗DGP。

图4 药物-疾病交集靶点基因通路富集分析

3 讨论

随着社会的发展，糖尿病已成为全球最大的公共卫生问题之一[8]。据国际糖尿病联合会2021 年全球糖尿病地图显示，全世界约有10.5%的成人患有糖尿病[9]。DGP 是糖尿病常见的慢性并发症之一，研究显示，50%以上血糖控制欠佳的糖尿病患者会出现DGP[2]。中医认为，DGP 可归于中医“消渴”“痞满”“呕吐”等范畴。其基本病机为消渴日久，脾胃受损，运化无力，胃失和降，气机不畅[10-11]。因此，DGP 多以脾胃虚弱兼气滞、痰浊、血瘀等辨证论治，基本治则以健脾和胃、益气消痞为主。补中益气汤中黄芪升阳固表，人参、甘草、白术补气健脾，当归养血和营，陈皮理气和胃，升麻、柴胡升阳举陷。全方具有升清降浊、补气健脾之功效。既往研究显示，补中益气汤可通过提高糖尿病模型大鼠血浆P 物质及胃窦干细胞因子（SCF）蛋白水平，增强SCF/kit 信号传导，改善大鼠胃肠蠕动功能，促进胃肠排空，从而起到治疗DGP的作用[12]。但目前补中益气汤治疗DGP 的相关机制研究相对较少，其机制尚不明确。由于补中益气汤中含多味中药，化学成分众多，且存在多种相互作用，传统实验研究方法难以全面深入地研究其有效成分、作用靶点及作用机制。网络药理学是基于系统生物学和生物信息学理论，以生物和医学大数据研究为核心，对药物进行多成分、多靶点、多通路的网络作用关系分析，因而可以更加系统、深入地分析中药方剂治疗疾病的作用机制[13]。

本研究利用网络药理学方法探索补中益气汤治疗DGP 的机制，获得补中益气汤中与DGP 相关的活性成分共185 个，其中三磷酸腺苷、呋喃色酮、十七醇、香芹酚、异黄酮等可作用于较多DGP 靶点。研究显示，高糖条件下，大鼠胃平滑肌细胞三磷酸腺苷含量下降，细胞能量代谢途径改变，线粒体能量代谢受抑制，糖酵解增加，进而可导致DGP 的发生[14]。呋喃色酮具有良好的抗氧化损伤、抗炎、抑制凋亡作用[15]。波谱分析显示，新鲜食用仙人掌块茎中的十七醇可有效降低小鼠血糖水平[16]。研究显示，香芹酚可减轻化疗药物盐酸伊立替康导致的肠黏膜炎，降低肠黏膜促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β），炎症相关指标核因子κB（NF-κB）、环氧合酶-2（COX-2）和氧化应激相关指标谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和氮氧化物（NOx）的表达水平[17]。香芹酚还可明显降低糖尿病小鼠的随机血糖以及凋亡相关因子丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1（PDK1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）水平，从而改善血管平滑肌细胞增殖与凋亡失衡[18]。此外，研究显示，富含异黄酮的大豆胚芽面食饮食可改善DGP 患者胃排空延迟，这可能与异黄酮的抗氧化应激作用有关[19]。DGP的发病与高血糖、氧化应激、凋亡、炎症反应等多种因素有关[20-22]。高血糖可导致胃肠肌间神经丛的神经元凋亡，影响胃收缩功能和胃电节律，从而导致胃排空速率减慢。氧化应激可导致胃肠道神经细胞退化、凋亡，胃肠道Cajal 间质细胞（ICC）氧化损伤、数量减少、超微结构改变，进而加重胃排空延迟。胃固有肌层巨噬细胞极化，炎性因子增加、抗炎因子减少也与DGP 的发生发展密切相关。综合上述关于补中益气汤核心活性成分及DGP 发病机制的相关研究结果，我们推测，补中益气汤治疗DGP 胃排空延迟的主要机制可能与控制血糖、改善氧化应激、凋亡及炎症反应等有关。

进一步分析发现，补中益气汤作用的关键靶点胰岛素（INS）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素-6（IL6）、内皮型一氧化氮合成酶（NOS3）、肾上腺素能受体（AR）、胰岛素样生长因子（IGF1）等与DGP 的发生发展密切相关。研究显示，对于1 型糖尿病小鼠，INS 治疗可通过保护肌间胆碱能神经元和ICC，有效延缓糖尿病胃轻瘫的发展[23]。AMP 依赖的蛋白激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AMPK/Akt）、PI3K/Akt 等通路可参与调节糖尿病大鼠胃平滑肌细胞凋亡、细胞增殖及ICC 损伤[24-26]。IL-6 作为一种促炎因子，在炎症加重DGP 患者胃排空延迟的过程中起着至关重要的作用[27]。NOS3 属于一氧化氮合酶，研究表明，胃肠一氧化氮合酶神经元损伤是导致DGP 的重要原因之一[28]。此外，研究发现，激活AR 可促进胃平滑肌细胞增殖，抑制胃平滑肌细胞凋亡，从而改善DGP 大鼠的胃排空延迟[29]。IGF-1 治疗能够下调高糖条件下体外培养的大鼠胃平滑肌细胞内质网应激和自噬相关蛋白的表达，通过抑制内质网应激和自噬改善DGP 胃排空延迟[30]。综上，我们推测补中益气汤可能通过作用于上述多靶点，抑制细胞凋亡、炎症反应、自噬，改善氧化应激和神经损伤，从而影响DGP 的发生发展。

GO 富集分析显示，补中益气汤可能通过调节神经递质受体活性、细胞凋亡相关酶活性、氧化还原酶活性、AMP 活化蛋白激酶活性、AR 活性、细胞因子活性、IGF-1 结合等多途径治疗DGP，与关键靶点的相关功能研究结果具有一定一致性。KEGG 通路富集分析进一步发现，24 条通路与DGP 密切相关。其中，AMPK 通路、PI3K/Akt 通路与凋亡有关，HIF-1 通路与缺氧损伤有关，cGMP/PKG 通路与胃肠道平滑肌细胞有关。研究显示，高糖条件下，活化的AMPK可通过调节p53、Akt、蛋白激酶A（PKA）、磷脂酶C（PLC）等的表达和活性，直接或间接促进大鼠胃平滑肌细胞凋亡，进而导致DGP 的发生[24]。去甲乌药碱可通过激活β2-AR/PI3K/Akt 通路抑制DGP 大鼠胃平滑肌细胞凋亡[25]。PI3K/Akt 通路激活还可促进糖尿病大鼠胃平滑肌细胞增殖，补充胃窦ICC 缺失[26]。HIF-1 的表达与缺氧程度和组织缺血状态密切相关。研究显示，DGP 大鼠胃黏膜HIF-1 表达上调，提示胃黏膜细胞缺氧可能是胃排空延迟的始动因素或关键步骤，在DGP 的发生发展中起重要作用[31]。磷脂酶C-肌醇三磷酸-钙离子/一氧化氮-环磷酸鸟苷酸-蛋白激酶G（PLC-IP3-Ca2+/NO-cGMP-PKG）通路可通过调节DGP 大鼠胃平滑肌细胞长度及细胞内Ca2+浓度，影响DGP 发生发展[32]。此外，KEGG 通路富集分析还发现，补中益气汤可能通过调节胰岛素抵抗通路、肾上腺素能信号传导通路、cAMP 信号通路等治疗DGP。上述分析结果与交集靶点的相关功能研究及GO 富集分析结果具有高度一致性。

综合上述网络药理学分析及相关实验研究结果，推测补中益气汤可能通过作用于多靶点、多通路抑制凋亡、自噬、氧化应激、炎症反应，调节胰岛素、血糖水平，从而改善胃肠道平滑肌细胞和ICC 损伤，以影响DGP 的发生发展。本研究为补中益气汤治疗DGP 提供一定理论依据，为后续进一步实验研究提供参考方向。但目前DGP 的相关研究仍相对较少，公共数据库中纳入的疾病相关基因相对有限。此外，由于中药复方的化学成分和作用方式较复杂，网络药理学研究仍存在一定局限性，尚不能完全反映药物活性成分与疾病靶点之间的相互作用，如实际发挥生物学效应的具体方式，上调还是下调等。因此，本研究结果仍有待后续实验研究进一步验证。