白及水煎剂对蒽醌类药物所致结肠黑变病豚鼠结肠黏膜超微结构的影响

张兆林 徐 虹 陈冻伢 刘 敏 陈建永

结肠黑变病（melanosis coli，MC）多见于长期便秘以及服用蒽醌类药物的患者[1-2]，如番泻叶、大黄、芦荟、鼠李等，它是一种黑色素或脂褐素沉积在结肠黏膜固有层的非炎症性肠道病变。MC 可能与结肠非腺瘤性息肉和低级别腺瘤的高发病率及数量有关[3-4]。一项动物实验研究显示，MC 豚鼠结肠组织中原癌基因c-myc 的表达显著升高，表明该疾病具有癌变倾向[5]。因此早期治疗MC，有着非常重要的意义。有研究表明，白及水煎剂可以改善MC，其机制可能是通过调节结肠组织Bcl-2 和Bax 表达，从而抑制细胞凋亡而发挥作用[6]。本次研究通过制备MC 模型豚鼠，同时给予10%白及水煎剂灌肠干预，观察肠黏膜特殊染色、超微结构以及流式细胞仪检测细胞凋亡率，探讨白及水煎剂对MC 的改善作用机制。

1 材 料

1.1 动 物 健康清洁级豚鼠40 只，雌雄各半，体质量（400±20）g，均由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。动物合格证号：SYXK（浙）2013-0184。采用架式笼养，每笼4 只，雌雄分笼，普通饲料喂养，自由饮水，环境条件为20 ℃左右的室温维持，相对湿度40%～60%，12 h 光照周期的屏障环境。符合动物实验伦理要求。

1.2 药 物 大黄、白及均采购自浙江省医药公司（杭州桐君堂中药饮片厂，批号20150713，大黄提取工艺：大黄饮片机械粉碎成粗粉，经70%乙醇回流提取液过滤，60 ℃减压浓缩，制成大黄提取液（每1 mL相当于3 g 大黄药液）。10%白及水煎剂制取工艺：白及饮片干燥、粉碎成粗粉，加入蒸馏水中煎煮过滤杂质，合并滤液水浴浓缩成10%白及水煎剂（每1 mL相当于0.1 g 白及药液）。以上实验药物制取均委托浙江中医药大学药学院完成。

1.3 主要试剂及仪器 甲醛（批号20150623）、无水乙醇（批号20140812）、戊二醛（批号20150422）、二甲苯（批号20150211）、高锰酸钾（批号20150510）、草酸（批号20150322）、25%乌拉坦（批号20140614）等购自上海试剂一厂；PBS（批号20150123）、Harris 苏木精液（批号20150313）、伊红染色液（批号20150718）等购自福州迈新生物技术有限公司；Annexin V-FITC 购自杭州联科生物技术有限公司。Becton Dickinson Facscalibour 流式细胞仪（美国BD公司）、FEITECNAI-10 电镜（飞利浦）等。

2 方 法

2.1 动物模型制备 40 只豚鼠适应性喂养1 周后，采用随机数字表法分为正常组8 只，模型组16 只和白及组16 只。全部豚鼠均放在铁笼中，每4 只单笼喂养，造模前禁食不禁水24 h。造模开始，模型组、白及组豚鼠均予大黄提取液6 g/（kg·d）连续灌胃60 d。灌胃第15 d 起，白及组予10%白及水煎剂灌肠，每周3 次，模型组予等量生理盐水灌肠；正常组常规饮水进食，同步喂养60 d。

2.2 标本取材 造模结束后，各组豚鼠均禁食、禁饮24 h，予25%乌拉坦按0.7 mL/100 g 的剂量腹腔注射麻醉处死。剖腹后立即剪取盲肠及全段结肠，沿纵轴剖开，留取适量结肠标本，用4 ℃生理盐水反复冲洗干净后，置于戊二醛、甲醛、液氮保存备用。

2.3 检测指标与方法

2.3.1 褪黑色素染色 结肠组织石蜡包埋3～5 μm切片，脱蜡；蒸馏水洗2～3 次；入0.25%高锰酸钾水溶液内2 h，水洗后再用1%草酸水溶液漂白水洗；镜下控制至细胞内外黑色素完全消失；常规HE 染色后，脱水、透明及封片，光学显微镜下观察。

2.3.2 透射电子显微镜 将结肠组织切成1 mm3大小，置于2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液中2 h，PBS 冲洗，1%四氧化饿固定2 h，PBS 再次冲洗；依次用乙醇、丙酮作梯度脱水处理，经低粘度Spurr 包埋剂包埋后，切片机半薄切片，甲苯胺蓝染色定位后切成厚度70 nm 的超薄切片，最后用柠檬酸铅及醋酸铀双重染色，置于透射电子显微镜下观察。

2.3.3 流式细胞仪 将冻于液氮中的结肠块用眼科弯剪刀放在60 μm 孔径的尼龙网上剪碎，PBS 冲洗，收集成单细胞后用95%乙醇固定，PBS 再次清洗，离心后弃上清液；加入1 mL Tritonx-100，室温下静置10 min；离心后弃上清液，加PBS 清洗后弃上清液；加1 mL RNASE 酶，置37 ℃水浴恒温箱振荡10 min；离心后弃上清液，加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混匀，避光室温放置15 min；加入300 μL Binding Buffer，1 h 内上机检测，应用流式细胞仪离子激发光波长488 nm，选定每样本计数10000 个细胞，所得资料输入BDISCONSORT30 计算机后应用相应程序软件处理，计算细胞凋亡率。

2.4 统计学方法 应用SPSS 21.0 软件包对数据进行统计处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。所有检验结果以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组豚鼠结肠黏膜肉眼观改变 肉眼观察各组结肠组织样本，正常组豚鼠结肠黏膜形态、颜色正常，MC 模型组结肠黏膜颜色明显加深，呈弥漫性黑褐色色素沉着，且由结肠近端向结肠远端逐渐变浅，而白及组豚鼠结肠黏膜颜色较模型组浅，见图1。

图1 各组豚鼠的结肠黏膜

3.2 各组褪黑色素染色比较 正常组褪黑色素染色阴性，模型组及白及组特殊染色均呈阳性改变，但模型组染色范围较白及组大。见图2。

图2 各组豚鼠结肠组织褪黑色素染色光镜图（×200）

3.3 各组豚鼠组织透射显微镜下比较 正常组：微绒毛排列紧密，形态规则，可见较多杯状细胞，嵴结构清晰，粗面内质网未见异常。模型组：微绒毛结构紊乱，可见多数上皮细胞胞浆内大小不等空泡样改变，细胞核形态不规则，变性空泡为肿胀的线粒体，内部结构杂乱不清晰，胞浆中细胞器的密度增加，偶可见凋亡上皮细胞。白及组：微绒毛排列较紧密，上皮细胞凋亡不明显，可见较多杯状细胞，个别线粒体轻度空泡样改变，核膜清晰，染色质无聚集，新生黏液空泡轻度增多，粗面内质网的整体结构排列不规则。见图3。

图3 结肠组织透射电镜观察

3.4 各组豚鼠组织细胞凋亡率比较 结果显示，与正常组相比较，模型组豚鼠的结肠上皮细胞凋亡率增高（P＜0.05）；白及组的细胞凋亡率较模型组下降（P＜0.05），见表1、图4。

图4 流式细胞仪检测各组豚鼠结肠黏膜细胞凋亡率

表1 各组豚鼠结肠上皮细胞凋亡率（%，）

表1 各组豚鼠结肠上皮细胞凋亡率（%，）

注：正常组常规饮水进食60 d；模型组为大黄提取液6 g/（kg·d）60 d；白及组为大黄提取液6 g/（kg·d）第15 d 起10%白及水煎剂灌肠，3次/周；与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

3 讨论

随着结肠镜检查的普及与提高，MC 的检出率也呈现增高趋势。西方国家MC 的检出率约在10%，国内资料报道其检出率约为1.78%明显低于西方国家[3]。MC 的发生与蒽醌类泻药的使用有95%的相关性，由于存在许多肠道病理状况促使于蒽醌类泻药的使用，MC 正变得越来越普遍[7]。

MC 缺乏特异的临床表现，它可以仅表现为肠镜下结肠呈“豹纹样”或“蟾蜍背样”的改变，也可出现腹胀、便秘、排便不适或腹部隐痛等，而这些症状与肠易激综合征的临床表现类似，其机制可能与色素沉积所致的炎性反应以及肠道神经系统受累有关[9]。MC 的组织学检查结果显示，大量富含色素的巨噬细胞沉积在结肠固有层，其余层均正常，同时可伴见浆细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润。MC 病理组织切片的特征表现为结肠层存在大片的色素颗粒，固有层胞质中可见含色素颗粒的巨噬细胞，程度较轻的病变组织可无明显黑变。本研究肉眼可见三组豚鼠结肠的不同，特殊染色方面，正常豚鼠结肠黑色素几乎不可见，褪黑色素染色阴性，而模型组及白及组特殊染色均呈阳性改变，且白及组染色面积较MC 模型组减少，表明结肠黑变病经白及水煎剂干预后，病变程度有所减轻。

MC 的发病机制，目前普遍认为与细胞凋亡存在一定的相关性。透射电镜能够观察到细胞在不同凋亡时期的特征性变化，而本研究结果亦与之相符。流式细胞仪能够检测细胞凋亡时细胞、亚细胞以及分子水平上所发生的特征性改变，本研究根据流式细胞术快速定性、定量的分析与分选单个细胞，检测豚鼠结肠上皮细胞凋亡，MC 豚鼠模型结肠上皮细胞凋亡率有明显升高，而经白及水煎剂灌肠后细胞凋亡率降低，表明药物干预后MC 有所改善。

MC 属于良性、可逆性病变，也有研究发现，MC与结肠癌存在一定的相关性，因此对于重度MC 应尽早干预。与西药相比，中医中药在治疗MC 方面发挥了独特的效果和优势。一项数据挖掘研究显示，中药治疗MC，用药以益气养阴、补血润肠为主，兼以理气祛瘀为法，必要时标本兼顾,灵活权变加减，可以取得较好的疗效[9]。

本研究结果显示，白及组结肠颜色、电镜下超微结构、结肠细胞凋亡率较模型组均有一定程度的减轻，说明白及水煎剂确实对蒽醌类所致MC 有一定的改善作用，其作用机制可能是通过抑制结肠上皮细胞凋亡来实现，仍需进一步研究佐证。