3种消毒剂场景化消杀效果研究

李 博，陈俊宇，张 林，王贵平

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

现如今，集约化养殖程度越来越高，养殖场中传染病流行的风险也在增加，规模化猪场中细菌病是最难以根治的疾病，而且发生的频率也越来越高[1]，尤其是在猪病毒性疾病暴发的情况下，混合细菌性疾病和继发感染更容易发生[2-5]，使规模化养猪场的生产和经济效益受到严重威胁[6-7]。

生物安全工作的重要性不言而喻，然而仍有部分养殖场户防控意识不强，虽然制定了严格的消毒程序，但在实际动物疫病防疫过程中并未切实做到位。消毒过后，残留病原微生物只要达到适宜的条件，就会迅速传播，暴发传染病。市面上多种消毒剂是在实验室试验验证它的消杀效果，而养殖场实际情况远比实验室复杂，消毒剂在养殖场生产场景中的消杀效果还需要进一步研究。本研究通过选用猪场中常见的3种消毒剂（进口过硫酸氢钾复合物粉、国产过硫酸氢钾复合物粉、烧碱溶液）在转群后地面粪便表面（场景1）、干清粪后地面粪渣（场景2）、猪舍门口脚踩盆（场景3）、猪场下水道储水池（场景4）、猪场门口消毒池（场景5）中，进行细菌消杀试验并评估其杀灭效果，为养殖场生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与试验地点

试验于2021年5月5日至8月31日在湖南农业大学进行。

1.2 材料

（1）消毒剂：进口过硫酸氢钾复合物粉，国内某代理商代理，推荐使用稀释浓度1∶200；国产过硫酸氢钾复合物粉，推荐使用稀释浓度1∶200，湖南某生物科技公司生产；烧碱溶液，推荐使用稀释浓度2%，某集团化学试剂有限公司生产。

（2）试验猪粪便：猪粪便均来自湖南省株洲市某规模化猪场送检样品。

（3）主要试剂：胰蛋白胨大豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 场景化一：转群后地面粪便表面消毒效果评估

（1）制造粪球。用送检的猪粪便制作宽约4 cm、长约5 cm、高约3 cm的半椭圆形干粪。

（2）泼洒消毒：分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃条件下，将3种消毒剂按照推荐浓度用泼洒的方式将100 mL消毒剂泼洒到粪球表面每个部分上。

（3）取样：分别在0（消毒前）、1、5、15和30 min后从粪球的底部、腰部、顶部3个表面点，用生理盐水浸湿的无菌棉签在小范围内轻蘸取样，放到1.5 mL离心管中。

（4）样品处理：向装有样品的离心管中加1 mL无菌生理盐水，充分震荡混匀后，6 000 r/min，离心5 min，将上清液弃掉，目的是洗掉样品中消毒剂成分。再加入1 mL无菌生理盐水，充分震荡混匀后稀释到合适浓度，备用。

（5）涂布：取最后稀释度的样品重新振荡，立即用移液器抽取0.1 mL样品于胰蛋白胨大豆琼脂培养基中，取涂布器均匀涂布30 s，至样品均匀涂满整个培养基表面，每个样品做两次重复。将涂布好的培养皿放入37 ℃恒温培养箱中，过夜培养12 h。

（6）菌落计数：平板上形成30～300个菌落属于有效范围，统计有效活菌数。

CFU=菌落数的平均值/10-n/0.1。

（7）细菌杀灭率计算：细菌杀灭率=（试验前样品中菌落数-消杀后样品中菌落数）/试验前样品中菌落数×100%。

1.3.2 场景化二：干清粪后地面粪渣消毒效果评估

（1）制造粪渣：用送检猪粪便制作半椭圆形干粪，放置到老旧搪瓷盘上（模拟在粗糙地面上），用铲子铲掉大块粪球后，会剩下细小粪球渣子。

（2）泼洒消毒：分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃条件下，将3种消毒剂按照推荐浓度用泼洒方式泼洒100 mL到粪渣上。

（3）取样：用生理盐水浸湿的无菌棉签分别在0（消毒前）、15和30 min时，对消毒后的粪渣蘸取取样，放到1.5 mL离心管中。

（4）样品处理、涂布、菌落计数、细菌杀灭率计算：同1.3.1。

1.3.3 场景化三：猪舍门口脚踩盆消杀效果评估

（1）制做脚踩盘：将1∶200进口过硫酸氢钾复合物、1∶200国产过硫酸氢钾复合物和2%烧碱溶液分别倒入搪瓷盘中，并用无菌毛巾完全浸入消毒剂，平铺到脚踩盘中（模拟脚垫）。

（2）踩踏模拟：试验人员先到脏乱地面上踩踏，保证鞋底上粘满带有细菌的泥土，然后在脚踏盘毛巾上踩踏。

（3）取样：分别在0（踩踏前）、5、15、30 s，每个时间点用生理盐水浸湿的无菌棉签对鞋底前部、中部、后部3个位置取样。

（4）样品处理：向装有样品的离心管中加入1 mL无菌生理盐水，充分混匀后，6 000 r/min，离心5 min，将上清液弃掉，目的是洗掉样品中消毒剂成分。再加入1 mL无菌生理盐水，充分震荡混匀后稀释到合适的浓度，备用。

（5）在试验人员踩踏完，等30 min后对脚踏盘中消毒剂抽取1 mL样品。用固体培养基培养细菌的方法来检测消毒剂在时间足够的情况下能否完全杀灭鞋底细菌。

（6）样品处理、涂布、菌落计数、细菌杀灭率计算：同1.3.1。

1.3.4 场景化四：猪场下水道储水池细菌消杀效果研究

（1）模拟养殖场下水道场景：将1∶400进口过硫酸氢钾复合物、国产过硫酸氢钾复合物和4%烧碱溶液各150 mL分别倒入烧杯中，露天放置。再向烧杯中加入150 mL含大量细菌的污水（细菌数在为5.6×106CFU/mL）。

（2）取样：每天向烧杯中加入不定量细菌污水液。30 min后用移液器从烧杯中取1 mL于1.5 mL离心管中，6 000 r/min，离心5 min，除去上清液，目的是洗掉样品中消毒剂成分，再加入1 mL生理盐水混匀，备用。同时定期补充水分维持300 mL的消毒剂容积（模拟下雨天补充水分）。

（3）细菌培养：取0.2 mL样品加入到含3 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基的5 mL玻璃试管中，放入37 ℃恒温摇床中180 r/min，过夜培养12 h。观察液体培养基是否变浑浊。

1.3.5 场景化五：猪场门卫消毒池消杀效果研究

（1）模拟养殖场门卫消毒池场景：将1∶200进口过硫酸氢钾复合物、国产过硫酸氢钾复合物和2%烧碱溶液各300mL分别倒入烧杯中，露天放置。

（2）取样、细菌培养：同1.3.4。

2 结果与分析

2.1 场景化一：转群后地面粪便表面消毒效果评估

由表1、表2、表3可知，在消杀1、5、15、30 min后，粪球表面细菌杀灭率：进口过硫酸氢钾复合物粉4 ℃为33.38%～85.30%，25 ℃为62.90%～97.37%，37 ℃为38.75%～90.00%；国产过硫酸氢钾复合物粉4 ℃为67.30%～81.79%；25 ℃为55.63%～66.89%；37 ℃为54.70%～61.90%；烧碱溶液4 ℃为99.59%～99.77%，25 ℃为65.32%～99.90%，37 ℃为99.31%～99.90%。

表1 4 ℃ 3种消毒剂对粪球表面细菌消杀效果

表2 25 ℃ 3种消毒剂对粪球表面细菌消杀效果

表3 37 ℃ 3种消毒剂对粪球表面细菌消杀效果

在4 ℃、25 ℃、37 ℃条件下，烧碱消杀效果比同时间点的其他两种消毒剂消杀效果均好，而且烧碱杀菌力持久强大，价格较低，在该场景消毒中更有优势。3种消毒剂均能杀灭粪便中绝大部分细菌，但还有小部分细菌并不能杀灭，推测原因可能是粪便中有机物干扰或耐消毒剂的细菌存在。

2.2 场景化二：干清粪后地面粪渣消毒效果评估

由表4、表5、表6可知，在消杀15、30 min后，粪渣中细菌杀灭率：进口过硫酸氢钾复合物粉4 ℃为95.49%～97.14%，25 ℃为99.27%～99.83%，37 ℃为99.94%～99.95%；国产过硫酸氢钾复合物粉4 ℃为99.05%～99.86%，25 ℃为99.91%～99.95%，37 ℃为97.78%～99.91%；烧碱溶液4 ℃为99.94%～99.95%，25 ℃为99.96%～99.97%，37 ℃为99.97%～99.98%。

表4 4 ℃ 3种消毒剂对粪渣消杀效果

表5 25 ℃ 3种消毒剂对粪渣消杀效果

表6 37 ℃ 3种消毒剂对粪渣消杀效果

3种消毒剂对粪便残渣中细菌杀灭效果均良好。烧碱杀菌力持久强大，价格较低，与其他两种消毒剂相比较而言，烧碱在该场景消毒中更有优势。

2.3 场景化三：猪舍门口脚踩盆消杀效果评估

（1）由表7可知，在消杀5、15、30 s后，鞋底细菌杀灭率：进口过硫酸氢钾复合物粉为84.16%～98.78%，国产过硫酸氢钾复合物粉为85.48%～98.04%，烧碱溶液82.52%～97.24%。在该场景消毒中，进口过硫酸氢钾复合物粉消毒剂更有优势。（2）消毒液对鞋底上细菌消杀30 min后，仍然有活菌存在。对这些细菌进行分离培养，可以看出有大量菌落形成。取这些菌落进行摇菌培养后用相同消毒液进行再次消杀，结果发现消毒完全无效。这些结果提示在鞋底存在耐消毒剂的细菌。

表7 3种消毒剂对鞋底上细菌杀灭效果

2.4 场景化四：猪场下水道储水池消杀效果研究

进口过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，第5天液体培养基开始变浑浊，说明第5天有细菌存活；国产过硫酸氢钾复合物粉消毒剂第8天培养基开始变浑浊，说明第8天有细菌存活；烧碱第3天培养基开始变浑浊，说明第3天有细菌存活。

在猪场下水道储水池消毒中，消毒液的更换时间：进口过硫酸氢钾复合物粉，4 d；国产过硫酸氢钾复合物粉，7 d；烧碱，2 d。国产过硫酸氢钾复合物粉消毒剂在该场景中消毒更有优势。

2.5 场景化五：猪场门卫消毒池消杀效果研究

进口过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，第9天培养基开始变浑浊，说明第9天有细菌存活；国产过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，第13天培养基开始变浑浊，说明第13天有细菌存活；烧碱第5天培养基开始变浑浊，说明第5天有细菌存活。

在猪场门卫消毒池消毒中，消毒液的更换时间：进口过硫酸氢钾复合物粉，8 d；国产过硫酸氢钾复合物粉，12 d；烧碱，4 d。国产过硫酸氢钾复合物粉消毒剂在该场景中消毒更有优势。

3 结论

在场景一，转群后地面上粪便表面消毒中，3种消毒剂均能对粪球表面细菌有效杀灭，推荐使用2%烧碱溶液对粪球表面消毒。

在场景二，干清粪后地面粪渣消毒中，3种消毒剂在4 ℃、25 ℃、37 ℃的条件下，均能有效杀灭粪便残渣中细菌，推荐使用2%烧碱溶液对粪球表面消毒。

在场景三，猪舍门口脚踩盆消毒中，3种消毒剂均能杀灭绝大部分鞋底上细菌，且消杀效果不相上下，推荐使用进口过硫酸氢钾复合物粉消毒。

在场景四猪场下水道储水池消毒和场景五猪场门卫消毒池消毒中，推荐使用国产过硫酸氢钾复合物粉消毒。

4 讨论

在不同场景化中，进口硫酸氢钾复合物（1∶200）、国产过硫酸氢钾复合物（1∶200）和2%烧碱溶液对细菌均有良好的杀菌效果。在转群后地面上粪便表面场景中，3种消毒剂对粪便表面场景中细菌消杀效果整体要弱于在对干清粪后地面粪渣场景，原因可能是在进行对干清粪后地面粪渣泼洒消毒时，粪渣体积小，也比较散，能够与消毒剂充分接触。泼洒完后粪渣较长一段时间都浸泡在消毒液中，有机物的干扰作用减弱了，能够充分消毒。而对转群后地面上粪便表面泼洒消毒时，虽然粪便表面每个部分都被泼上了消毒剂，但是消毒液会流下去，而且粪便表面的消毒液也会挥发，再加上粪便表面有机物干扰作用，所以消毒剂对干清粪后地面粪渣的消杀效果要强于粪便表面中细菌消杀效果。在生产应用过程中，遇到转群后地面残留粪便时，饲养人员应先将大块粪便及时铲走，然后用大量含消毒剂的水冲洗地面，对地面粪渣进行充分消毒。

在猪舍门口脚踩盆消毒场景中，脚踩盘中消毒液当天就检测到活菌，建议定期更换消毒液来避免耐消毒剂的细菌出现；同时强烈建议采用其他方法（如换鞋）代替踩踏消毒的方式。

猪场生产实际情况比实验室复杂，在猪场下水道储水池消毒中，建议消毒剂更换时间：进口过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，2～3 d；国产过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，3～5 d；烧碱溶液应每天更换1次。在猪场门卫消毒池消毒中，建议消毒剂更换时间：进口过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，1周；国产过硫酸氢钾复合物粉消毒剂，1～2周；烧碱溶液，3 d。

在场景一、二、三中，均有部分细菌不能被杀灭。推测其原因可能是粪便中耐消毒剂的细菌存在或有机物干扰。细菌抵抗消毒剂的作用机制主要包括形成生物膜、改变表面渗透性、外排性和导致酶失活等[8]。有研究发现，某些种类的病原微生物长期暴露低浓度消毒液后，就会产生耐药性，一定剂量消毒剂作用下仍能存活，其传染性和致病性增加[9]。采用多种消毒剂交替使用，或者选择加热、臭氧、UV（紫外线）等替代措施进行消毒。联合使用多种处理方法协同作用来更彻底地消除有害微生物，避免消毒剂抗性的产生和传播。当遇到有机物干扰时，消毒剂消杀效果会受到影响。由于消毒剂与有机物结合，会减少与病原微生物作用，有机物也起到保护微生物的作用，降低了消毒剂杀菌能力。在这种情况下，必须提高消毒剂的浓度，延长消毒时间方能达到消毒目的。在消毒前应对消毒场地进行彻底地打扫，清除杂物以防影响消毒剂与病原微生物的接触，可大幅提高消毒效果。