利用丁酸梭菌调理牛蛙肠道健康技术试验

麦晓勇，蒋 魁，洪敏娜，刘曦瑶，杨 铿，文国樑

(1.广州市欣海利生生物科技有限公司，广东 广州 510300；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300)

近年来，牛蛙已成为我国水产养殖重要的名特水产品之一。在我国广东、广西、江西、湖南、浙江等地区均有较大规模养殖，养殖产量逐年递增，牛蛙年产量已超60 万吨。目前牛蛙养殖比较混乱，没有集成一套科学、无污染、可持续的养殖技术，且部分养殖户大量使用抗生素，造成食品安全问题。丁酸梭菌已经被广泛应用于畜禽、水产养殖中，但在牛蛙养殖中还未见报道。笔者将丁酸梭菌应用于拌料投喂牛蛙，旨在探究丁酸梭菌对牛蛙肠道结构及菌群的影响。

一、材料与方法

1.材料

丁酸梭菌菌种来自中国水产科学研究院南海水产研究所，丁酸梭菌菌剂产品由广州市欣海利生生物科技有限公司提供，产品为发酵原液直接灌装的液体菌剂，丁酸梭菌菌量≥8×108CFU/毫升。

2.试验方法

在广东省汕头市澄海区牛蛙养殖场，选取A、B、C 组牛蛙养殖户3 个同批次四脚小牛蛙苗进行试验。

A 组：进四脚小牛蛙后，定期使用丁酸梭菌，每瓶500毫升拌料40千克，饲喂3天后停3天菌剂拌料，以此为1个周期。

B 组：进四脚小牛蛙后，不定期使用丁酸梭菌拌料投喂，察觉到牛蛙肠道较差而使用35天。

C 组：进四脚小牛蛙后，全程不使用丁酸梭菌。

3.检测与分析

(1)肠道组织上皮细胞切片分析。试验第90天，餐后1小时，在健康牛蛙饱食状态下随机网捕牛蛙。每口池随机取5只牛蛙解剖观察肠道、肝脏等。再取其肠道，置于10 毫升4%多聚甲醛中保存。取肠道组织上皮细胞，由武汉塞维尔生物科技有限公司进行组织切片分析。

(2)牛蛙肠道菌群结构分析。试验第90天，餐后1 小时，在健康牛蛙饱食状态下随机网捕牛蛙。每口池随机取5 只牛蛙，再取其肠道置于10 毫升菌群测序保存液中保存，进行牛蛙肠道细菌群落结构分析。选择16S rDNA 的V4 区为扩增区间，扩增引物为515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3')，由明科生物技术(杭州)有限公司使用Illumina MiSeq 平台进行高通量测序分析。

二、结果

1.牛蛙个体大小及解剖肠道观察

试验90 天后结果显示，定期使用丁酸梭菌拌料投喂的A组牛蛙个体显著比不定期使用的B组和未使用的C组大，且其肝脏红润，肠道更粗(图1)。

图1 牛蛙解剖肠道观察

2.丁酸梭菌对肠道结构的影响

试验90 天后，使用显微镜观察发现，定期使用丁酸梭菌拌料投喂的A组牛蛙的肠道壁厚度比不定期使用的B组和未使用的C组明显增厚，肠黏膜更多；而不定期使用的B组牛蛙肠道比C组肠黏膜更多，肠道壁更厚；C组牛蛙肠道壁薄，内肠道黏膜很少(图2)。

图2 牛蛙肠道切片对比

3.丁酸梭菌对牛蛙肠道菌群的影响

试验结果显示，定期使用丁酸梭菌的A组牛蛙肠道菌群各菌所占比例分布均匀，且有益菌梭状芽孢杆菌高达24.8%，高于B 组的8.40%和C 组的1.8%；而A 组变形菌门所占比例为17.77%，低于B组的46.70%和C组的71.35%。

三、讨论

传统的高密度养殖牛蛙模式，牛蛙每亩产量高达3万千克，由于密度高、投料量大，养殖过程中经常出现肠道问题，养殖户通常使用抗生素处理肠炎，对食品安全带来很大的隐患。为了牛蛙养殖业的可持续性发展，养殖户必须改变观念，合理控制养殖密度，定时使用有益菌调理肠道，预防肠道疾病，保证食品安全。

牛蛙作为一种特种养殖品类，多数人在研究高密度养殖技术及病害的防治(如爱德华氏菌病、白内障病、温和气单胞菌病和嗜水气单胞菌病等)。丁酸梭菌作为肠道内定植能力强的有益菌，已经被广泛应用于畜禽及水产养殖中，能够有效地提高鸡、仔猪、对虾等的生长速率，改善肠道菌群结构，提高肠道消化吸收能力。本文通过定期使用丁酸梭菌拌牛蛙饲料投喂发现，丁酸梭菌能显著提高牛蛙的生长速率，增厚肠道壁，有效提升肠道内有益菌群的比例。

四、小结

丁酸梭菌应用于牛蛙养殖，通过定期拌料、饲喂3天停3天的方法，可在牛蛙肠道内形成有益菌优势，改善肠道结构，提高牛蛙生长速率和养殖成功率。