两种免疫增强剂对克氏原螯虾生长、非特异性免疫性能的影响研究

傅纯洁，葛红星，赵士力，李前方

(1.东海县水产技术推广站，江苏 东海 222300；2.江苏海洋大学，江苏 连云港 222005；3.东海县黄川镇农业技术推广服务站，江苏 东海 222322；4.江苏瑞沃农业发展集团有限公司，江苏 连云港 222300)

目前的研究已经证实，维生素、中草药制剂能提高水产动物的免疫能力，但在克氏原螯虾方面的研究相对较少。本研究通过筛选可能具有免疫强化性能的中草药作为免疫增强剂，评估其不同添加比例对克氏原螯虾非特异性免疫和生长性能的影响，以期筛选适宜克氏原螯虾用免疫增强剂。

一、材料与方法

1.试验材料

虾苗在实验室内暂养1周后选取健康、肢体健全、平均规格为(5.5±2)克/只的克氏原螯虾开始试验。

2.试验设计

本试验将维生素C、维生素E按1∶1的比例混合成维生素制剂后以0.01%、0.02%、0.04%的浓度，选取甘草、金银花、黄芪为试验原料，按1∶1∶1的比例混合成中草药制剂后以1%、2%、4%的浓度添加至饲料中(N1、N2、N3、N4、N5、N6)，并设置对照组N0，每个处理3个平行。试验分组以及两种免疫增强剂添加浓度见表1。饲料配方参考徐维娜等(2011)，主要成分为1.50%的磷酸二氢钙、0.30%的氯化胆碱、14.70%的玉米粉、20.00%的鱼粉、40.00%的黄豆粉、2.00%的鱼油，按照添加制剂的浓度不同添加21.50%、21.49%、21.48%、21.46%、20.50%、19.50%、17.50%的小麦粉。

表1 各组饲料成分 %

3.试验管理

试验场地选择21 个1 米2的水池，在每个水池中放500 克的水草。每个水池中放入3 个气石充氧，保证溶氧充足。每个水池中放入20 只虾，分别投喂经不同处理的饲料，日投喂量为克氏原螯虾体重的5%左右，每天投喂3 次，饲养40 天。水池的水位保持在15～20 厘米，确保在试验期间溶氧≥6.0 毫克/升、pH (7.5±1.5)、氨氮＜0.5 毫克/升。试验水温为自然水温，温度保持10～20℃。每天观察虾死亡情况，及时捞出死虾并进行数量记录，同时检查死亡原因。

4.生长指标测定

选取增重率、特定生长率、存活率和饲料系数4个指标用以评估生长性能，计算公式为：

增重率(%)＝(Wt-W0)/W0×100；

特定生长率(%/天)＝(lnWt-lnW0)/t×100；

存活率(%)＝X1/X0×100；

饲料系数＝F/(W1-W0)；

式中：W0为小龙虾平均初始体质量(克)，Wt为小龙虾的平均最终体质量(克)，t 为养殖天数，F表示投饵量(克)，X1为试验结束时克氏原螯虾的成活数量，X0为试验开始时克氏原螯虾的初始数量。饲养试验结束，试验虾饥饿8小时后称重。

采用Excel 和SPSS Statistics 26 对试验数据进行分析。单因子方差分析(one-way ANOVA)分析差异，P＜0.05作为差异显著水平。

5.非特异性免疫指标测定

试验结束后，从每个试验组中抽取3只克氏原螯虾用于样本的收集。用无菌注射器从虾体围心腔中取血，得到的血清用于碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)等测定。酶活采用南京建成生物研究所试剂盒进行测定，具体操作按说明书进行。

二、结果

1.饲料中添加不同免疫增强剂对克氏原螯虾生长情况和饵料系数的影响

使用不同的饲料投喂40 天，克氏原螯虾的生长情况见表2。各组特定生长率与对照组没有显著差异(P＞0.05)。N1、N3、N4组增重率与对照组有显著 差 异(P＜0.05)， 其 中N3组 增 重 率 仅 为432.14%，相较其他各组增重率最低，N1、N4组的增重率分别为546.34%、552.62%，明显高于对照组N0(P＜0.05)。同时存活率中N1、N4组与对照组差异显著，N4组存活率在试验各组中最高，达到95.00%，而N6组存活率最低，仅为73.33%。试验各组的饲料系数均显著低于对照组N0(P＜0.05)，其中N4组的饲料系数最低，为2.22。

表2 两种免疫增强剂对克氏原螯虾生长情况和饵料系数的影响

综合试验各组的生长情况，随着两种免疫增强剂的添加浓度上升，存活率都呈下降趋势，N1、N4为同种添加制剂中存活率最高组别，同时两种免疫增强剂添加浓度达最大时，存活率均小于对照组。对于增重率、特定生长率两项生长指标，随添加浓度的上升，呈下降趋势。

2.饲料中添加不同免疫增强剂对克氏原螯虾SOD、AKP和ACP酶活性的影响

饲料中添加不同免疫增强剂对克氏原螯虾SOD、AKP 和ACP 酶活性的影响如图1～图3 所示，其中SOD 酶活性N1组最高、N6组最低，且N1组显著高于N0组(P＜0.05)。在维生素制剂添加中N1组SOD酶活性最高，且高于中草药制剂组中活性最高的N5组；N1、N2、N3组随着维生素制剂添加浓度提高，SOD酶活性呈下降趋势，而添加中草药制剂的N4、N5、N6组则呈现先升高、再下降的趋势。试验各组AKP酶活性均随着两种免疫增强剂浓度的提高而上升，其中N6组AKP 酶活性最高，N4组活性最低，且试验各组均与N0组有显著性差异(P＜0.05)。而ACP 酶活性中N6组最高、N4组最低。N1、N2、N3组随着维生素制剂添加浓度提高，ACP 酶活性呈现先升高、再下降的趋势，而N4、N5、N6组则随着中草药制剂添加浓度的提高而呈上升趋势。其 中ACP 酶活性中N6组≈N2组，且 显 著高于N0组(P＜0.05)。

图1 两种免疫增强剂对克氏原螯虾SOD酶活性的影响

图2 两种免疫增强剂对克氏原螯虾AKP酶活性的影响

图3 两种免疫增强剂对克氏原螯虾ACP酶活性的影响

三、讨论

在饲料中加入维生素可以提高甲壳动物的抗应激能力，然而笔者研究中显示在较低浓度维生素添加时，克氏原螯虾的存活率、增重率较高，而过多的维生素添加会产生负面影响。对其他水产动物的研究中也发现类似的现象(吴桂玲等，2008)。这可能是维生素制剂中过多的维生素E 会抑制克氏原螯虾对其他维生素如维生素A、维生素K的吸收导致。本试验结果表明，饲料中添加两种免疫增强剂相对于对照组，克氏原螯虾的生长发育存在差异。

克氏原螯虾饲料中添加免疫增强剂的研究还较少。在本研究中，与N0组相比，添加免疫增强剂的饲料可提高克氏原螯虾的生长性能和存活率。饲料中添加维生素制剂和中草药制剂可显著提高南美白对虾的生长率，同时降低死亡率(Linan-Cabello 等，2015)。本试验中N1和N4组克氏原螯虾的特定生长率较高，达到了4.24%和4.27%。同时本试验显示，两种免疫增强剂在克氏原螯虾的生长中起重要作用，存活率的提高与免疫增强剂的添加有实质性的关联(王芸等，2012)，可能是免疫增强剂提高了克氏原螯虾的环境适应能力，减少机体消耗，从而促进了物质能量的积累导致(Wang 等，2012)。其中N4组的克氏原螯虾存活率达到了最高，说明添加剂量过高或过低都可能影响克氏原螯虾的存活率。本试验中，随着两种免疫增强剂浓度的提高，AKP酶活性随之上升，均在最高浓度组达到最高，而随着维生素制剂浓度的提高，ACP酶活性呈现先上升、再下降的趋势，并在0.02%添加浓度时达到最高；SOD 酶活性则在0.01%浓度的维生素制剂添加中达到最大值。研究表明，在N1组，0.01%浓度的维生素添加量是克氏原螯虾生长和免疫的最佳条件。同时这一结果也表明，在免疫力强的条件下，特定生长率也最高。

四、小结

本研究表明，饲料中添加两种免疫增强剂能够促进克氏原螯虾存活、生长，同时提高其免疫力。将克氏原螯虾的存活率和特定生长率作为主要考虑因素，综合考虑免疫能力，建议在本次试验设计的条件中，选择N1组作为免疫增强剂的最佳浓度，即维生素制剂添加量为0.01%。