环境中抗生素抗性基因的分布、检测及消除研究进展

龙进宝，幸鸿雁，李航军，汪明金，费孝桐，魏 嘉

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

抗生素作为药品和饲料添加物被长期应用，对人类社会产生了巨大的影响。大部分抗生素不能被人体或动物体吸收，而以代谢产物的形式排出［1］。由于抗生素在畜牧养殖中的长期滥用，导致养殖动物肠道内诱导出抗生素抗性菌（Antibiotic Resistant Bacteria，ARB），抗生素与ARB 一起通过日常生活、医疗、养殖业等活动进入到环境中［2］。诱导并增强了其他微生物耐药性，微生物通过自身突变或产生可移动遗传元件（MGEs）发生水平转移来获得相关抗性，进而通过改变药物作用位点、产生特定酶使抗菌药物钝化或被灭活、改变药物代谢途径等机制对抗生素产生抗性［3，4］。抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes ，ARGs）可以在非病原体、病原体甚至是远源相关生物之间转移革兰氏阴性和阳性菌等［5］，通过水平基因转移的方式来增加ARGs 在环境中的迁移与传播。

ARGs 不仅会污染环境，还对人体健康造成威胁。研究报道，抗生素除杀灭病原菌外，还对机体的免疫功能有影响，少数β-内酰胺类抗生素属增强机体免疫功能的抗生素，大环内酯、喹诺酮类抗生素属与免疫系统有协同作用的抗生素［6］。检测及消除ARGs 对于保护生态环境和机体健康尤为重要。

1 环境中抗生素抗性基因分布现状

1.1 养殖场中的抗生素抗性基因

随着养殖业工业化、大型化发展，抗生素被广泛使用到养殖业中。养殖场中的ARB 和ARGs 通过废水和粪便排放、养殖场人员进出、肉制品生产等过程进入环境，致使环境中的抗生素抗性基因丰度增加，扩散效率可能超过亲代细菌［7］，诱导多重抗性菌的产生。赵翰斌等［8］从肉鹅养殖场污水处理系统的样品中分离出了一株对诺氟沙星有抗性的细菌并从中发现了ARGs。邹威等［9］通过分析几家规模化畜禽养殖场的粪便样品发现，不同规模的养猪场粪便ARGs 污染程度为中型最多、大型次之、小型最少，不同规模养鸡场粪便中ARGs 相对丰度并无显著差异，且鸡粪中ARGs sul 和erm 的丰度高于猪粪。赵晶等［10］采集不同规模养殖场的粪肥、养殖场附近的地表水、土壤及种植的蔬菜，利用液相色谱串联质谱技术对氟喹诺酮类抗生素含量进行分析，均检测出氟喹诺酮类抗生素，且含量为粪肥最多、蔬菜最少。金明兰等［11］从养禽场周围不同水环境中分离出56株大肠杆菌，检测其抗生素敏感性及抗性基因，结果发现18 株磺胺类抗性菌，且其中存在多重磺胺类抗性菌株。

Mahmoud 等［12］从埃及的12 个肉鸡场的肠内物质中筛选出四环素抗性基因tet（M）、tet（W）、tet（Q）和tet（G），结果表明，tet（W）在所有肠样品中都有表达。Tamminen 等［13］筛 选 鉴 定 了9 种 不 同 类 型ARGs，但发现在水体、鱼类、沉积物中并没有使用过抗生素的记录。Andrea 等［14］在没有抗生素选择压力的地方发现了抗生素耐药肠球菌。在没有使用过抗生素的养殖场环境中也检测到了ARB 和ARGs，鱼类生活的环境中含有抗性基因，并且在很多水产养殖场中都检测到了多重耐药菌株。

1.2 土壤中的抗生素抗性基因

抗生素和AGRs 残留主要通过施肥、废水排放或再生水灌溉等方式释放到土壤环境中［15］，使土壤性质发生改变，使土壤受到严重污染。抗生素滥用导致的AGRs 环境扩散和积累被认为是生物污染，并逐渐成为全世界较为关注的环境污染问题［16］。粪便施肥是抗生素进入环境的一种方式［17］。沈聪等［18］在养鸡场鸡粪中共检测到132～168 种ARGs亚型，其中氨基糖苷类最多。黄福义等［19］通过高通量荧光定量PCR 对比分析猪粪有机肥对水稻土ARB 和ARGs 分布发现，使用猪粪有机肥的水稻土中ARGs 的种类和丰度明显增多。医疗废物填埋积累导致磺酰胺和多药耐药基因的类型变多，并增加了抗性基因在土壤中的迁移率［20］。抗生素及抗性基因暴露于环境中，含有抗生素的废物应谨慎管理，以免ARGs 污染。

1.3 水环境中的抗生素抗性基因

水环境中的ARGs 来源多，如工业废水、医疗废水、生活污水和养殖场废水等。冀秀玲等［21］在黄浦江水域的2 个养殖场污水贮流池中共检测出了7 种四环素类、4 种磺胺类的ARGs。黄福义等［22］在福建省尾矿库库区水体中发现97 种ARGs、11 种MGEs。胡静［23］对污水处理厂进水及出水样品进行检测，夏季检测到18 种ARGs，冬季检测到20 种ARGs，表明ARGs 的分布有季节性差异。Jang 等［24］检测海洋中的ARGs 丰度发现，南大洋ARGs 的绝对丰度比西太平洋低1.8 倍，β-内酰胺和四环素抗性基因在所有样本中均占主导地位。

2 抗生素抗性基因的检测方法

检测ARGs 的方法有微生物培养法、PCR 检测、宏基因组学法等。传统微生物培养法操作简单灵活、标准化程度高、成本低，为细菌种属鉴定及分子生物学检测提供了基础，但费时较长；PCR 是最经典、最常用的ARGs 检测方法，较传统微生物培养，效率有很大提高；宏基因组学通过直接提取和克隆来自微生物的DNA 进行基因组分析，无需对微生物进行分离纯化，简化了微生物培养步骤，但对设备要求较高。金明兰等［25］将样品接种于营养肉汤培养，进行分离鉴定、敏感性检测以及耐药性分析发现，不同来源菌株对磺胺类药物的抗性不同，其中大肠杆菌对磺胺类抗生素抗性较高，且具有多重抗生素抗性。白龙等［26］建立了一种可以同时检测鸡源细菌中5 种四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS、tetX的多重PCR 体系。江月等［27］使用高通量荧光定量PCR和实时荧光定量PCR，在水库水体中检测出118 种ARGs，其中β-内酰胺类ARGs 最多。Ma 等［28］用宏基因组学研究人类、猪和鸡的粪便样本中的ARGs，发现了高水平的四环素、红霉素和氨基糖苷类耐药基因，且3 种粪便中含有共同的ARGs，表明抗性基因可能通过某些途径在环境中不断传播。

3 抗生素抗性基因的消减及去除方法

3.1 人工湿地处理系统

人工湿地技术因其工艺流程简单、低耗高效等优点已普及并运用于不同国家的炼油厂、屠宰场、食品加工、纺织工业、采矿等领域的废水处理［29］。程羽霄等［30］对潮汐流人工湿地以增加隔板、种植植物等方式进行优化，发现对7 类21 种ARGs 去除率高达83.82%～100.0%。张子扬等［31］采用垂直潜流人工湿地处理ARGs 后发现，sulⅠ、sulⅡ、sul Ⅲ的平均去除率分别为89%、88%、84%。

Lamori 等［32］评估了人工湿地的去除效果，肠球菌的ARGs HF183、intl1 和ermF 的总体去除率分别为84.0%、66.6%、67.2%和13.1%。Huang 等［33］研究了人工湿地三段组合对ARB 和ARGs 去除的影响，结果表明，3 种混合人工湿地均可从废水中去除98%以上的替米考星和多西环素，对ARGs intI1、ermB、ermC、ermF、tetW 和tetG 也有很高去除效率。人工湿地处理系统能有效削减抗性菌和抗性基因，但容易使抗性基因积累，且需要针对不同废水性质设计相应的处理系统。

3.2 氯消毒和紫外消毒

在20 世纪60 年代时，紫外线消毒就被应用在水处理中［34］，加氯消毒是最常用的手法，但其单独使用时对ARGs 的去除效果不理想。抗生素抗性的去除效率取决于氯的剂量和紫外线强度，大剂量的紫外线或氯气抑制了ARGs 的转移频率［35］。紫外线/氯是去除ARGs tetM 和blaTem 最有效的方法，其次分别是氯化和紫外辐射［36］。尽管紫外线和氯气处理可有效灭活细菌，但仍存在抗性基因降解不完全的现象［37］。Virender 等［38］研究发现，氯化能有效减少红霉素和四环素的抗性基因，其中红霉素和四环素抗性基因的去除率分别为0.42±0.12 和0.10±0.02 log，40%的红霉素耐药基因和80%的四环素耐药基因在氯化后仍然能存在于废水中。因此，即使在消毒后，ARGs 仍降解不完全，质粒携带的抗性基因仍可能转移到其他细菌中。

3.3 臭氧消毒

臭氧（O3）是一种有效降低磺胺甲恶唑（SMX）的绿色氧化剂［39，40］，其灭菌过程属生物化学氧化反应。O3处理过程中，pH 是关键性因素，随pH 增大，O3分解为自由基的速率也随之提高［41］。张佳丽等［42］研究发现，在溶液体积为1 L、初始青霉素G 为50 mg/L、初始pH 为11、O3为15 mg/L、反应温度为20 ℃的条件下，青霉素G 的去除率相对较高，O3氧化可迅速降解水中青霉G，5 min 后青霉素G 去除率为100%。O3的利用效率低，在臭氧化过程中可能形成一些有毒的消毒副产物（DBPs）［43］，在适当臭氧剂量下，臭氧化和生物活性炭过滤工艺可有效去除水中的磺酰胺［44］，并将工艺中的消毒副产物降低至水质安全标准水平。Stange 等［45］采用臭氧处理ARGs 5 min 后发现，ARGs 减少了4.3～4.6 log。

3.4 电离辐射技术

电离辐射技术去除抗生素抗性基因的原理是利用Χ 射线、γ 射线以及高能电子束来破坏细胞内DNA 链。基于电离辐射技术的消毒效率不受季节的影响，与紫外和O3相比，具有耗电量低、对消毒后的 细 菌 有 明 显 的 再 生 抵 抗 力 等 优 点［46，47］。Shen等［48］研究表明，30 kGy 吸收剂量的γ 射线作用后，抗生素发酵残留物中的红霉素含量降低56%，大环内酯类抗性基因（ereA，ermB，mefA和mpfB）的丰度下降了1.0～1.3 log，且辐射对残留物中的营养成分影响不明显，发酵残留物可作肥料。Chu 等［49］通过γ 射线处理红霉素生产中的废水，在50 kGy 吸收剂量下，ARGs、红霉素、抗菌活性和化学需氧量（COD）的去除率分别为96.5%～99.8%，90.0%、47.8%和10.3%。研究对比电离辐射技术、臭氧化和热处理技术对头孢菌素发酵残留物中抗生素降解率及抗性基因失活率，结果表明，3 种方法都能有效去除ARB和ARGs，但在100 kGy 剂量下的去除效果最佳［50］。

4 小结

自发现抗生素以来，从药物到添加剂，抗生素的使用越来越广泛。但抗生素的广泛使用使得部分细菌产生耐药性，所造成的疾病也更难治疗。在长期的抗性环境中，部分的细菌基因也随之改变，导致多重抗性菌的出现及抗性基因的传播。中国已实施全面禁抗，减少抗生素的使用，抗生素造成的环境问题亟待解决，ARB 和ARGs 的检测与消除方法仍需进一步研究。