克林霉素磷酸酯纯化工艺研究

于荣，王鸿发，王少云，马文军(宁夏泰益欣生物科技有限公司，宁夏 银川 750205)

0 引言

克林霉素磷酸酯(Clindamycin Phosphate)属于半合成的抗生素类药物，是一种含有18个C原子的抗生素，其化学名称为6-(1-甲基-4-丙基-2-吡咯烷碳酸胺基)-1-硫代-甲基-7-氯-6,7,8-三脱氧-L-苏式-α-D-半乳糖吡喃糖苷-2-二氢磷酸酯；分子式为：C18H34ClN2O8PS；分子量为504.97[1]。该药作为盐酸克林霉素的衍生物，作用机制与盐酸克林霉素相似，主要通过抑制蛋白的合成来达到抗菌效果。克林霉素磷酸酯的抗菌谱与林可霉素也相同，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌等革兰氏阳性菌以及消化球菌、消化链球菌、脆弱类杆菌、梭杆菌属、真杆菌、丙酸杆菌等厌氧菌均具有抗性[2]。其具有脂溶性强、渗透性好、吸收快、抗菌活性高的优势，并且具有广谱、高效和副作用小的特点，因此克林霉素磷酸酯在国内外已广泛应用[3]。

我国是生产克林霉素磷酸酯的生产大国，其制备工艺大都采用的是传统合成工艺，即以盐酸林可霉素为制备原材料，POCl3、2，2-二甲氧基丙烷分别为磷酰化试剂和保护剂，并经过上柱水解，结晶浓缩等后处理方法，获得克林霉素磷酸酯[4]。然而传统合成提取纯化工艺收率低于国际同行业先进水平，所需的试剂价格较高，导致生产成本偏高。同时，对周围环境也会造成一定的影响。本研究主要是通过对提取纯化的工艺进行优化，以降低生产成本，简化操作，提升收率为目的，也为克林霉素磷酸酯的生产创造了良好的经济效益。因此，此项工作的开展将带来很好的社会价值和市场前景，对抗生素类药物的研究具有重要的意义。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

YP4002电子天平(上海越平科学仪器有限公司)，XDW25摇瓶机(江苏同君仪器科技有限公司)，HSDHG电热恒温鼓风干燥箱(上海和晟仪器科技有限公司)；pH计；温度计；三角瓶。

1.2 试剂

纯化水、NaOH不同浓度溶液、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、甲醇、乙醇。

2 材料与方法

2.1 材料来源

本试验所用盐酸克林霉素由宁夏泰益欣生物科技有限公司提供。

2.2 方法

收率=目的产物(实际)生成量/目的产物的理论生成量×100%或生成目产物的原料量/原料进料量×100%。

3 结果与分析

3.1 中和溶剂对克林霉素磷酸酯收率的影响

克林霉素磷酸酯经过水解后可产生过量的盐酸，导致水解液呈强酸性，而脱色纯化过程中所需要的酸性条件pH为4.0～5.0，因此，需要加入常用的碱性溶剂进行中和后才能进行下一步反应。常用的碱性溶剂有氢氧化钠水溶液、氨水溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液和水。调节完成后转移至浓缩釜中进行浓缩。具体结果如表1所示。

由表1可见：(1)若使用自来水进行稀释中和醇化物水解产生的盐酸，需要耗时周期较长，在中和过程中浪费大量的时间，增加生产成本，降低生产进度。(2)若采用氨水进行中和，氨水在水解液中与盐酸反应生成氯化铵和水，在浓缩形成粗品的过程中不会形成杂质影响克林霉素磷酸酯的质量，但会出现乳化层，影响收率。(3)添加不同浓度的NaOH溶液至水解液中，分层较好，但收率较低，随着NaOH浓度的增加克林霉素磷酸酯的收率呈下降趋势。(4)用无水碳酸钠和无水碳酸氢钠溶液中和水解液中的盐酸，均能取得较好的效果，两种溶剂均为弱碱，既能起到中和碱的作用，对产品的质量和收率无影响，但无水碳酸氢钠消耗的溶剂较多，因此无水碳酸钠是中和溶剂的最优选择。

3.2 柱洗溶剂对克林霉素磷酸酯收率的影响

水解液经无水碳酸钠中和后打入浓缩罐中进行浓缩除去溶液中的丙酮，浓缩结束后将稀释液上柱，同时开柱底出水阀，室温下进行上柱吸附，流速控制在1 000～1 200 kg/h。上柱结束，静置吸附30 min。上柱完成后采用不同的溶剂进行纯化顶洗，本研究主要采用纯化水、乙醇和甲醇。具体结果如表2所示。

由表2可知，采用不同溶剂纯化顶洗树脂柱对克林霉素磷酸酯的收率具有较大的影响。首先采用乙醇进行冲洗再用甲醇或纯化水冲洗，此过程中获得克林霉素磷酸酯的成品收率较高，其余溶剂收率均较低。因此将稀释液上柱吸附一定时间后，根据克林霉素磷酸酯在不同溶液中的溶解度不同，选择不同的溶剂进行冲洗树脂柱，冲洗掉稀释液中未被树脂柱吸附的杂质，达到提取纯化的效果。然后再用克林霉素磷酸酯的易于溶解的溶剂冲洗树脂柱，将克林霉素磷酸酯冲洗下来，这种冲洗方式有助于提升克林霉素磷酸酯的收率。

3.3 浓缩养晶时间对克林霉素磷酸酯收率的影响

浓缩是一种通过高温减压减少溶液中的溶剂，增加溶液中溶质的浓度，最终获得结晶的方法。在执行过程中将浓缩罐的温度升高至60～70 ℃，压力保持在≤-0.08 MPa，克林霉素磷酸酯在获得顶洗液之后进行浓缩至有结晶析出时，加入乙醇和活性炭回流脱色，但回流脱色的时间对克林霉素磷酸酯的纯化具有一定影响，本研究考察回流时间对收率的影响，回流时间为1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h，然后进行自然降温，将结晶液置于离心机中离心后即可获得克林霉素磷酸酯粗湿品，母液回收。具体结果如图1所示。

图1 回流脱色时间对克林霉素磷酸酯收率的影响

由图1可知，加入乙醇和活性炭回流脱色过程中，回流脱色的时间对克林霉素磷酸酯的收率具有一定影响，当随着回流时间的延长收率呈现出上升的趋势，回流时间达到2.0 h时其收率达到峰值，收率为79.2%，继续延长回流时间，克林霉素磷酸酯的收率呈下降趋势，因此，克林霉素磷酸酯的回流脱色时间以2.0 h为宜，回流过程中温度对克林霉素磷酸酯的收率可能影响较大。

3.4 重结晶温度对克林霉素磷酸酯收率的影响

重结晶是将已得到的克林霉素磷酸酯粗品在水溶液中加热溶解，以提高克林霉素磷酸酯的溶解度，首先向结晶釜内加入一定量的纯化水后将温度升至40～50 ℃，加入克林霉素磷酸酯粗品，继续升高温度至80～90 ℃，使其完全溶解，开始向反应釜内滴加二甲基甲酰胺，滴加过程中会析出大量固体。滴加完毕，缓慢冷却至一定温度后。将其导入离心机中离心，湿品用无水乙醇淋洗。本研究主要考察将温度降至-5～0 ℃、0～5 ℃、5～10 ℃、10～15 ℃、15～20 ℃和20～25 ℃后，不同温度区间内，对克林霉素磷酸酯收率的影响。具体结果如图2所示。

图2 重结晶温度对克林霉素磷酸酯收率的影响

结果表明：温度对重结晶工程中克林霉素磷酸酯收率具有较大的影响，在温水中加入克林霉素磷酸酯粗品，温度升高至80～90 ℃确保样品全部溶解，降低温度后有利于样品的析出，由图2可知，温度降至5～10 ℃后克林霉素磷酸酯的收率最高，当温度继续降低时，收率呈下降趋势。

3.5 工艺稳定性验证

在优选出来各单因素最佳结果的基础上，确定每个因素的考察范围，将每个阶段收率最高的条件为最优条件，形成最优组合后验证克林霉素磷酸酯提取纯化工艺的稳定性，优选结果采用正交试验法选出最优组合。以无水碳酸钠为中和溶剂、以乙醇-甲醇为柱洗溶剂、回流脱色时间为2.0 h、重结晶温度为5～10 ℃为最优工艺。

按照最佳工艺进行了5次平行试验，试验结果如表3所示。

表3 提取纯化工艺稳定性验证结果

由实验结果可知，5次平行试验得到的克林霉素磷酸酯平均结晶收率在74.04%以上，各组实验间波动较小。

4 结论

本研究为了提升克林霉素磷酸酯的产量，以现有工艺为基础进行优化，分别考察了中和溶剂种类、柱洗溶剂种类、浓缩结晶时间及重结晶温度等条件对克林霉素磷酸酯合成收率的影响。其结果显示中和溶剂以无水碳酸钠为最优试剂；柱洗溶剂以先用水冲洗再用乙醇或甲醇进行冲洗为最优组合；浓缩养晶时间为2.0 h时，5～10 ℃的重结晶温度时克林霉素磷酸酯的收率最高。详细的工艺参数可进一步优化。